抗凋亡蛋白HAX-1对脂多糖（LPS）所致心肌损伤的作用及其机制

发布时间：2020-07-01 07:24

【摘要】：心血管疾病是一种临床常见的疾病类型,许多心血管疾病都伴随着炎症反应的发生,如心肌炎、扩张型心肌病、急性心梗、心力衰竭等等。诱发炎症的常见致病菌是革兰氏阴性菌(G-),如大肠杆菌,其产生的内毒素--LPS(脂多糖)是引起机体炎症反应的主要致病成分,当其在血液中大量堆积时会形成内毒素血症,最终诱发多器官功能衰竭。近年来,内毒素对于心脏方面的损害逐渐引发诸多研究学者的关注。HAX-1(HS1-associated protein X-1,HS1相关蛋白X-1)是一种新型的细胞凋亡调节蛋白,有研究发现,某些疾病(如:光化性角化病)炎症反应过程中,细胞内炎症因子的合成表达增加,而抗凋亡蛋白HAX-1呈现下调趋势。但是,对于心肌细胞炎症损伤过程中,HAX-1可能起到的作用以及其作用机制还没有相关的研究报道。HAX-1作为一种新型的细胞凋亡调节蛋白,其在心肌细胞内广泛表达,是发挥心肌保护作用的抗凋亡蛋白之一。因此,我们推测HAX-1可能在LPS诱导的心肌炎症损伤过程中起到一定的作用。本课题以实验室自主分离获取的乳鼠心肌细胞(Neonatal Rat Cardiac Myocytes,NRCMs)作为研究对象,采用脂多糖(LPS)处理乳鼠心肌细胞建立心肌细胞炎症损伤模型,通过HAX-1腺病毒转染乳鼠心肌细胞调整细胞内HAX-1的表达量,探索HAX-1对心肌细胞炎症损伤的影响以及可能的作用机制,以期能够获得治疗心肌炎症损伤的新思路。目的:研究抗凋亡蛋白HAX-1对乳鼠心肌细胞炎症损伤的影响。方法:1.选取出生1-3天的SD大鼠新生乳鼠,体外分离、培养NRCMs,并用抗α-SMA抗体通过免疫荧光法对NRCMS进行鉴定;2.LPS处理乳鼠心肌细胞,运用MTT、Q-PCR法设计并建立心肌细胞体外炎症损伤模型,并通过Western Blot法检测NRCMs炎症损伤时细胞内HAX-1蛋白的表达情况;3.构建可在心肌细胞内表达的HAX-1腺病毒载体,并转染进入乳鼠心肌细胞使细胞内HAX-1蛋白表达水平相应的上调或者下调,然后用LPS处理NRCMs建立体外炎症损伤模型,通过Q-PCR、Western Blot法研究探索HAX-1对LPS所致心肌细胞炎症损伤的影响,以及其可能的作用机制。结果:1.成功分离并培养鉴定乳鼠心肌细胞NRCMs。本实验采用一种有效而实用的NRCMs分离培养的方法,得到生长状态良好,分离纯度达到90%以上的心肌细胞,能够保证实验研究的科学性,严谨性,准确性;2.LPS诱导的NRCMs炎症损伤模型中,NF-κB炎症信号通路激活,细胞内炎症因子转录水平的表达与正常组相比增加5倍(IL-1β)和9倍(IL-6),HAX-1蛋白的表达水平明显下调。结果表明,HAX-1可能在LPS诱导的乳鼠心肌细胞炎症损伤中具有一定的作用;3.HAX-1过表达时,与GFP模型组相比,NRCMs内相关炎症因子m RNA水平的合成表达减少约30%,NF-κB炎症信号通路中IκBα蛋白表达量增加30%左右,磷酸化蛋白表达量(P-p65、P-IκBα)下调约25%。结果表明,HAX-1可能通过抑制IκBα蛋白的磷酸化降解,进而抑制NF-κB炎症信号通路的活化,减少下游蛋白的表达,下调心肌细胞炎症因子m RNA水平的表达,在NRCMs炎症损伤中发挥保护作用。结论:乳鼠心肌细胞NRCMs炎症损伤中,HAX-1通过抑制LPS诱导的IκBα表达水平的下调,以及降低p65、IκBα蛋白的磷酸化,进而抑制NF-κB炎症信号通路的激活,下调细胞内炎症因子的转录合成表达,从而降低心肌细胞炎症损伤,发挥保护作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

心肌细胞,荧光,平滑肌肌动蛋白,免疫荧光法

图 2.4.1 乳鼠心肌细胞培养不同时间细胞形态学特征（100×）2.4.2 乳鼠心肌细胞 NRCMs 的免疫荧光鉴定乳鼠心肌细胞分离培养 4d 后，用抗 α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的一抗经由免疫荧光法对心肌细胞进行鉴定。荧光倒置显微镜下进行观察，如图 2.4.2，可见抗 α-SMA 抗体特异性染色的红色荧光，以及 DAPI 特异性细胞核染色蓝色荧光，细胞计数后发现心肌细胞的纯度能够达到 90%以上，完全可以满足后续科学实验研究的需要。

均匀分布,细胞形态学,传导性,节律性

2.4.1 乳鼠心肌细胞 NRCMs 的形态学特征倒置显微镜下观察，可见刚分离出的乳鼠心肌细胞分散均匀多呈球形或椭球型，且存在部分细胞膜不光滑的异常形态细胞及碎片；培养24h后（如图2.4.1），镜下观察细胞已基本贴壁完全且均匀分布，细胞密度较大时，可明显观察到贴壁细胞出现自发的搏动，但搏动的频率和节律不一样；继续培养 2-3d，细胞逐渐生出伪足相互接触，最终相互交联形成密集的细胞簇，呈放射状，细胞的自发搏动强烈并且具有一定的节律性、传导性。

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