靶向抑制PAI-1促进内皮祖细胞抗静脉血栓的作用及机制研究

发布时间：2020-07-01 06:27

【摘要】：随着近年来生活方式的改善,静脉血栓(Venous thrombosis VT)的发病状况越来越普遍,给个人健康和家庭经济带来负担。随着干细胞疗法的兴起,越来越多的研究开始关注内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)在血栓再通方面发挥的作用及其潜在临床应用价值。EPCs是一种存在于骨髓中的多能祖细胞,在血栓病理条件下被募集到VT病灶位点,通过修复损伤的血管发挥溶解血栓的作用。随着对EPCs回输疗法研究的深入,越来越多的研究开始关注在EPCs联合治疗策略的探索。纤溶酶原激活物抑制剂1(Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)是纤溶系统中纤溶酶驱动蛋白水解的主要负调控因子,在纤维蛋白溶解过程中通过抑制组织型纤溶酶原激活蛋白和尿激酶纤溶酶原激活蛋白的作用抑制纤溶酶原向纤溶酶的激活,是潜在的VT治疗的靶点。目前,PAI-1在EPCs介导的血栓再通过程中所扮演的角色尚没有完全阐释清楚。为了探讨靶向抑制PAI-1对EPCs介导静脉血栓再通作用的影响及其机制,我们在大鼠下腔静脉狭窄法VT模型中,利用慢病毒感染体系对回输的EPCs进行PAI-1抑制,并通过4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)实验、伤口愈合实验以及基质胶(matrigel)EPCs管腔形成实验体外检测抑制PAI-1对EPCs增殖、迁移和管腔形成能力的影响。同时,我们还通过免疫组化实验和荧光标记EPCs体内追踪实验检测PAI-1对EPCs回输VT缓解血栓能力的影响。另外,我们还通过RT-qPCR和Western blot实验,探讨靶向抑制PAI-1影响EPCs回输VT缓解的分子机制。首先,我们通过密度梯度离心和EPCs诱导培养基(EGM-2MV)培养获得有表型和功能的EPCs;并利用293T细胞质粒转染慢病毒包装体系获得PAI-1-siRNA和NC-siRNA慢病毒。其次,MTT实验结果表明,PAI-1-siRNA慢病毒感染24小时后,EPCs的增殖能力增强。而且,伤口愈合实验结果表明,PAI-1-siRNA慢病毒感染后,EPCs的迁移能力增强。Martigel实验结果表明,PAI-1-siRNA慢病毒感染后,EPCs的管腔形成能力增强。另外,EPCs回输对血栓部位EPCs检测实验的结果表明,PAI-1-siRNA慢病毒感染能促进EPCs在VT位点的归巢(homing)。血栓病灶的免疫组化实验结果表明,PAI-1-siRNA慢病毒感染能促进EPCs介导的血栓再通。同时,血栓病灶新血管形成情况分析的结果表明,PAI-1-siRNA慢病毒感染能增加EPCs回输导致的血栓部位微血管形成数量增加。最后,RT-qPCR和Western blot实验结果表明,回输PAI-1-siRNA慢病毒感染的EPCs能促进血栓病灶组织中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的转录水平表达以及蛋白水平表达。通过以上研究我们发现,靶向抑制PAI-1能促进EPCs的增殖;靶向抑制PAI-1能增强EPC的迁移和归巢能力;靶向抑制PAI-1能增强EPCs体外和体内的管腔形成能力;靶向抑制PAI-1的EPCs回输能增加血栓横截面的毛细血管数量;靶向抑制PAI-1的EPCs回输能促进血栓病灶部位VEGF的表达。本研究对于深入了解PAI-1在EPCs介导的VT再通反应中发挥的作用及机制具有重要意义。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543
【图文】：

图 1.1 VT 形成过程中的凝血级联反应，引自 Bruce Furie[29]循环中的许多血细胞也与 VT 的形成有关（图 1.2）。血小板能够促进凝血的增加、纤维蛋白血块的形成和被中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophilextracellultraps，NETs）捕获[33]。在人和小鼠的 VT 模型下，血小板通过招募多种固有免

图 1.2 VT 形成过程中各种血细胞的作用，引自 Roger J. S. Preston[55]1.1.1 血流速度异常改变与 VT血流速度的过缓或过急都会引发 VT。一项研究检测了 76 名偏瘫病人双腿

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本文编号：2736399