Rbfox2调控Cav1.2钙通道可变剪接在高血压中的作用

发布时间：2020-07-03 02:10

【摘要】：背景:血管平滑肌细胞的电压门控L型钙通道(L-type calcium channels,LTCC)Ca V1.2的激活引起Ca2+内流,对维持血管肌源性张力和血压起着至关重要的作用。可变剪接作为一种转录后调控机制,它可以调控Ca V1.2钙通道产生不同的外显子拼接来发挥精细调控通道的功能。Rbfox2是一种剪接调控因子,在神经发育的过程中它可以调控Ca V1.2前体m RNA的可变剪接事件。但是,Rbfox2在调控血管Ca V1.2通道的功能以及在高血压中的作用及机制尚不清楚。目的:探索高血压血管中Rbfox2及Ca V1.2的exon 9*和exon 33的表达是否改变,研究Rbfox2对Ca V1.2的exon 9*和exon 33的调控作用,及对Ca V1.2钙通道功能和血管肌源性张力的影响。方法:分别利用克隆RT-PCR和Western blotting技术检测大鼠肠系膜动脉含exon 9*和exon 33的Ca V1.2钙通道m RNA以及Rbfox2蛋白的表达水平。在细胞水平,使用si RNA敲降Rbfox2后,检测对exon 9*和exon 33的调控作用,并用全细胞膜片钳技术检测Rbfox2对Ca V1.2钙通道电生理特性的影响。利用微血管张力检测系统,检测Rbfox2对肠系膜动脉肌源性血管张力的影响。结果:在高血压大鼠的肠系膜动脉中,含exon 9*的Ca V1.2钙通道升高10.3%,而含exon 33的Ca V1.2钙通道降低了10.5%。由于负性调控型Rbfox2(dominantnegative isoform,DN Rbfox2)升高,高血压动脉中Rbfox2总蛋白的表达水平增加约3倍。在血管平滑肌细胞中,我们发现敲降Rbfox2可以增加含exon 9*的Ca V1.2钙通道表达水平,同时降低含exon 33的Ca V1.2钙通道表达水平。通过全细胞膜片钳,发现减少Rbfox2可以使血管的Ca V1.2钙通道的稳态激活(steady-state activation,SSA)和稳态失活(steady-state inactivation,SSI)曲线向超极化的方向移动,这导致钙窗电流转向更负的膜电位,使得通道更易打开。此外,敲降大鼠肠系膜动脉中Rbfox2后,还会增加由压力诱导的血管肌源性张力。结论:Rbfox2通过动态调控exon 9*和exon 33的表达来调节血管的Ca V1.2钙离子通道的功能,从而影响血管肌源性张力。因此我们的研究阐明了在高血压动脉中Ca V1.2钙离子通道的功能上调的分子机制,并为临床治疗高血压提供一个潜在的靶点。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.1
【图文】：

血管平滑肌细胞,细胞核,细胞的,肠系膜动脉

32 1：Rbfox2 主要表达在血管平滑肌细胞细胞的细胞核中。（A）和（B）通过 RT-PCsternblotting 检测脑（Brain）、主动脉（Aorta）和肠系膜动脉（MA）中 Rbfox2 的表现 Rbfox2 蛋白主要表达于主动脉和肠系膜动脉中，GAPDH 为内参。（C）MA 和 VS免疫荧光染色，左边是 Rbfox2（抗体 1:100 稀释），中间是 -smooth muscle actin（00 稀释），DAPI 表示细胞核，最右侧的是合成图。. 高血压大鼠肠系膜动脉中 Rbfox2 表达水平升高同aV1.2 的 exon 9*和 exon 33 表达异常高血压大鼠的血管平滑肌中，对 CaV1.2 外显子的可变剪接相比于正常鼠呈现出明显不一样的剪接模式，这可能会影响血管肌源性张力[17]。因们检测了阻力血管中 Rbfox2 的表达水平，以及 CaV1.2 外显子的可变剪接

高血压大鼠,肠系膜,大鼠,心脏体

20显示了SHR和WKY大鼠的一些基本生理特征，如尾动脉血压和心脏体重比。相比于 WKY 大鼠，SHR 大鼠的尾动脉血压明显的增高，以及心脏体重比也显著增加。表 20：大鼠基本生理或病理特征Rats Age(wk) HW(g) LVW(g) BW(g) HW/BW(mg/g) SBP(mmHg) nWKY 14 0.83±0.07 0.56±0.09 283.3±17.0 2.9±0.2 132.0±6.5 6SHR 14 0.86±0.06 0.63±0.04 236.9±21.2 3.6±0.3* 202.5±8.1* 6HW：心脏重量； LVW：左心室重量；BW：体重；SBP：收缩压。与 WKY 组相比，*P<0.05，非配对检验。利用克隆 RT-PCR 我们检测了 CaV1.2 的 exon 9*和 exon 33 的表达量，发现在 SHR 大鼠的肠系膜动脉中 exon 9*的表达量增加约 10.3%（图 2A），而 exon33 的表达则降低了约 10.5%（图 2B）。Western blotting 发现，相比于 WKY 大鼠，在 SHR 大鼠的肠系膜动脉中 Rbfox2 蛋白的表达量升高大约 3 倍（图 2C）。

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