TET2在低剪切应力诱导EndMT中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-04 07:29

【摘要】：【背景】动脉粥样硬化(As)为动脉内膜损伤导致的慢性炎症增生性反应,好发于动脉的分支和分叉等低剪切应力区域。前期研究表明,TET2为DNA羟甲基化酶,低剪切应力下调TET2表达,过表达TET2抑制低剪切应力诱导的As病变。【目的】探讨TET2对低剪切应力诱导内皮间质转化的影响及其作用机制。【方法】采用平行平板流动腔系统分别在低剪切应力(4dyn/cm~2)、生理层流剪切应力(15dyn/cm~2)环境下灌流6小时,观察低剪切应力对EndMT以及TET2表达的影响;TET2 shRNA慢病毒转染人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)构建低表达TET2血管内皮细胞,观察TET2shRNA对EndMT的影响以及Wnt/β-Catenin信号通路下游靶基因MYC与AXIN2表达的影响;LV-TET2慢病毒转染HUVECs构建高表达TET2血管内皮细胞,采用平行平板流动腔系统,低剪切应力条件下灌流6小时,观察TET2过表达对低剪切应力下EndMT的影响。Western Blot免疫印迹检测血管内皮细胞表面抗原CD31、VE-Cadheri-n、Pecam1的表达、间充质细胞表面抗原Vimentin、α-SMA、FSP-1的表达、Wnt/β-Catenin信号通路下游靶基因MYC与AXIN2的表达以及TET2的表达。罗丹明鬼笔环肽染色检测TET2 shRNA对血管内皮细胞形态、骨架的影响;划痕实验检测TET2 shRNA对血管内皮细胞迁移的影响;MTT实验检测血管内皮细胞增殖的情况;流式细胞仪检测血管内皮细胞周期的变化。【结果】与生理层流剪切应力相比,低剪切应力组血管内皮细胞表面抗原VE-Cadherin的表达显著下降,然而间质细胞的表面抗原Vimentin表达明显上调,表明低剪切应力促EndMT。同时,低剪切应力组TET2的表达较生理层流组低,说明低剪切应力下调TET2的表达。Western blot检测显示:TET2 shRNA下调内皮细胞标记物VE-Cadherin、CD31、Pecam1的表达,上调间质细胞标记物Vimentin、α-SMA、FSP-1的表达,表明TET2 shRNA促EndMT。TET2 shRNA上调Wnt/β-Catenin信号通路下游靶基因MYC、AXIN2的表达,表明TET2表达下调可以激活Wnt/β-Catenin信号通路。低剪切应力环境下,LV-TET2组内皮细胞标记物VE-Cad-herin、CD31的表达增加,而间质细胞标记物Vimentin、α-SMA的表达下调,表明LV-TET2抑制低剪切应力诱导的EndMT。罗丹明鬼笔环肽染色的结果表明,TET2 shRNA组HUVECs微丝增粗、应力纤维增加,细胞骨架重排。细胞划痕实验结果显示TET2 shRNA组HUVECs的迁移能力增强。MTT实验结果表明:TET2 shRNA组的HUVECs增殖与对照组相比无明显差异。流式细胞术结果表明:TET2 shRNA组的细胞周期与对照组相比无明显差异。【结论】低剪切应力下调血管内皮细胞TET2的表达,上调MYC、AXIN2的表达,促EndMT。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

血管内皮细胞,转染效率,荧光显微镜观察

第 3 章实验结果第 3 章实验结果3.1 建立 TET2 高表达、低表达的血管内皮细胞使用慢病毒转染技术，将 LV-TET2、TET2 shRNA 转染血管内皮细胞，分别构建低表达 TET2 以及高表达 TET2 的血管内皮细胞。转染 96 小时后，采用荧光显微镜观察，结果表明内皮细胞转染效率较高(图 3.1），符合实验要求。

低剪切,应力对,剪切应力

图 3.2 低剪切应力对 VE-Cadherin 和 Vimentin 表达的影响低剪切应力下调 VE-Cadherin 表达；B.低剪切应力上调 Vimentin**P<0.01vs 15dyn/cm2组，n=3。剪切应力下调 HUVECs TET2 的表达用 Western blot 检测低剪切应力对 HUVECs TET2 蛋白表达的影剪切应力下调 HUVECs TET2 的表达（图 3.3）。

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