下丘脑室旁核HMGB1对大鼠急性心肌梗死后外周交感神经活性的影响及机制研究

发布时间：2020-07-04 05:37

【摘要】：研究背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于冠状动脉的急性持续性缺血缺氧,进一步引起心肌细胞出现坏死,是常见的心血管疾病,其发病率与致死率呈逐年上升趋势。其中,心律失常是AMI常见的临床表现,而梗死后室性心律失常(ventricular arrhythmias,VAs),尤其是室性心动过速(ventricular tachycardia,VT)、心室颤动(ventricular fibrillation,VF),是 AMI患者死亡和致残的最重要原因。因此,早期治疗和预防梗死后VAs成为降低AMI患者死亡率的重要措施,而如何找到预防与治疗AMI后心律失常的药物作用靶点及开发治疗AMI后心律失常的相关药物成为国内外研究的热点。目前,已得到广泛认同的AMI后心律失常发生的机制有:AMI后自主神经重构、心肌电生理重构、心室重构,以及心梗后交感神经、副交感神经的分布、密度以及活性的失衡。其中,外周交感神经活动增强是AMI发生后最重要的病理生理学反应与临床特征。另有研究表明,中枢神经系统也参与了交感神经活动的调节。而目前中枢发病机制的研究主要集中于中枢心血管调节区,如下丘脑室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus,PVN)与延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM),主要通过炎症、氧化应激等相关信号通路对AMI损伤起调控作用。其中,PVN是调节体液平衡和交感神经兴奋的重要中枢,可以通过感受脑室室周器脑脊液的变化和脑干区域压力,血容量和化学信号的变化,对心血管功能进行调节,在交感神经活动调控中起重要作用,也被称为“交感流出道”。有关研究指出,在侧脑室注入炎症因子,能够在一定程度上刺激交感神经的兴奋性,并且PVN炎症因子表达的增高和交感神经兴奋性增强有很大的关系。因此,如果能在中枢神经系统内找到调控外周交感神经活动的作用靶点,势必会为AMI后心律失常的临床治疗提供新的途径。高迁移率族蛋白(High Mobility Group Protein,HMG)属于非组DNA结合蛋白,广泛分布于高等真核生物的细胞核内,包括HMGA、HMGB、HMGBN三个亚群;HMGB亚群中进一步分为HMGB1、HMGB2、HMGB3其中,HMGB1的含量最多,因在进化过程中其序列高度保守,几乎存在于所有的真核细胞中,同源性高达99%,是唯一能够被释放到细胞外发挥其胞外生物学活性的蛋白质。人类的HMGBI基因位于13号染色体长臂上的1区2带,其相对分子量为25KD,普遍分布于机体的各项器官,如肝脏,肺脏及脾脏等中均存在,除在肝、脑组织中主要存在于胞浆外,在大多数组织中存在于胞核。在正常生理情况下,HMGB1在细胞核内与DNA的结合是松散的,但当细胞受到机械损伤或坏死的时候,HMGB1易于从受损的细胞核内释放到细胞外,继而诱发炎症反应。由于HMGB1在炎症性疾病的发病机制中发挥重要作用,因此亦被认为是机体坏死细胞发出的内源性危险信号。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路对于维持脑的正常生理活动起着重要的作用,如基因的增殖、分化以及死亡等。目前在哺乳动物中研究最多的MAPK通路是ERK1/2,JNKs及p38通路。有研究证明,在中枢PVN内,ERK 1/2信号通路在调节心肌梗死后心衰中交感神经的活性起着重要作用。因此,我们推测在AMI发生后,中枢PVN内可能存在HMGB1的表达,并且通过对大鼠中枢PVN内双极套管植入后微量泵注射HMGB1抑制剂(抗-HMGB1-多克隆抗体,Anti-HMGB1 polyclonal antibody,以下简称 Anti-HMGB1-Ab),观察HMGB1对外周交感神经活性的影响,更好地解释HMGB1与心梗后心律失常的关系并探讨其可能的信号传导通路,为心肌梗死后心律失常的治疗和预防提供理论支持与药物研制的新靶点。研究目的:本课题以大鼠AMI模型为研究对象,采用中枢PVN内双极套管植入后微量泵给药方式,研究AMI后中枢PVN内HMGB1的表达及其对外周交感神经活性的影响,并探讨其可能的作用机制。从形态学与分子生物学角度,观察各组大鼠中枢PVN内HMGB1及ERK蛋白的表达情况;从功能学角度,观察各组大鼠外周交感神经活性的改变,共同来证实在大鼠AMI发生后,中枢PVN内可通过HMGB1表达的上调参与AMI后心律失常的调节,而这一过程很可能是通过ERK信号转导途径完成的。研究方法:1.大鼠中枢PVN双极套管植入购置的SD大鼠两只一笼经过7天的适应期后,进行中枢PVN内双极套管植入术,通过一次性预埋导管,可解决后续多次给药时的密封难题,导管密封性好,可有效防止药液溢出流失从而造成实验数据误差。2.大鼠AMI模型的建立与分组实验大鼠分为以下四组:I-空白对照组(Control组);II-假手术组(Sham组):大鼠开胸后左冠状动脉前降支仅穿线不结扎;III-MI组:使用永久性结扎左冠状动脉前降支的方法制作AMI模型;其中MI组再分为MI+IgG组和MI+Anti-HMGB1-Ab 组(将 10ug 的 Anti-HMGB1-多克隆抗体稀释到10ul 的 TBS(pH=7.4)缓冲液中,每次注射10ul,以0.5μL/min的速度微量泵注射,隔日注射一次,连续7天;MI+IgG组中IgG注射的计量及频次同前)。3.大鼠AMI后第7天,在呼吸机支持下,用电刺激仪行程序性电刺激测定心律失常的诱发率及易感性评分。4.大鼠AMI后第7天,左腰腹部纵行切开,暴露肾脏,分离左侧肾交感神经,用生物机能实验系统记录外周肾交感神经活性。5.在体实验结束后,经中枢PVN内双侧注射亚甲蓝,再将大鼠断头取脑,制作冰冻切片,确定中枢PVN置管是否成功。6.在体实验结束后,即刻取下心脏,采集心脏组织进行Masson染色检测大鼠急性心肌梗死造模是否成功,同时测定大鼠心梗面积,心梗面积达30-50%的大鼠纳入实验组。7.在体实验结束后,分别抽取各组大鼠左心室内血液,采用ELISA方法检测血浆中NE浓度。8.采用免疫组化方法检测各组大鼠中枢PVN内HMGB1的表达。9.采用Western blot方法检测各组大鼠中枢PVN内HMGB1及ERK蛋白的表达情况。研究结果:初始实验的115只大鼠中,78只纳入实验(其中31只在PVN置管及心梗模型制备中死亡,6只由于心梗面积低于30%未被纳入实验),并随机分为4组:Ⅰ组:Control 组(n=15);Ⅱ组:Sham 组(n=15);Ⅲ组:MI+IgG 组(n=26);Ⅳ组:MI+Anti-HMGB1-Ab 组(n=22)。1.我们参照Paxinos-Watson大鼠脑立体定位图谱,根据中枢PVN位置参数,通过大鼠脑立体定位仪定位准确后,行中枢PVN内双极套管植入术。2.在AMI造模过程中观察结扎线以下心肌颜色变暗,局部波动减弱为标准,心电监护提示Ⅰ、Ⅱ、aVL、aVF等导联至少两个导联ST段抬高0.2mv,提示心肌梗死造模成功。3.我们在对大鼠进行了程序化电生理刺激后发现,在电极放置过程中,未见大鼠自发VAs,在电生理研究中未见大鼠死亡。Control组与Sham组VAs发生率为 10.0%,明显低于 MI+IgG 组(13/26,50%)和 MI+Anti-HMGB1-Ab 组(8/22,36.4%)。Control组与Sham组心律失常易感性评分接近0分,而MI+IgG组大鼠易感性评分为3.4±0.85分、MI+Anti-HMGB1-Ab组易感性评分为1.5±0.56分。以上结果表明MI后大鼠心律失常的诱发率、易感性指数均明显增加,而经中枢PVN内给予Anti-HMGB1-Ab后可显著改善MI后心律失常易感性。4.我们采用生物机能实验系统记录外周肾交感神经活性,发现Control组与Sham组大鼠的RSNA水平相比并无显著差异,而MI+IgG组与MI+Anti-HMGB1-Ab组RSNA的表达与基础值相比均有一定的变化,且与MI+IgG组相比,MI+Anti-HMGB1-Ab 组的 RSNA 反应明显减低(0.06±0.01 uv.s vs0.11±0.01 uv.s,p0.05)。5.我们通过中枢PVN双极置管经微量泵注射亚甲蓝后,制作脑组织冰冻切片,观察并确定中枢PVN置管是成功的。6.我们采用Masson染色进一步证实心肌梗死造模成功并评估梗死面积,结果显示心肌细胞呈红色,纤维组织呈蓝色。7.我们又采用ELISA法测定各组大鼠血浆中去甲肾上腺素水平,发现MI+Anti-HMGB1-Ab组大鼠血浆中去甲肾上腺素水平虽高于Sham组(17.101±0.490 pg/mL vs 14.949±0.562 pg/mL,p0.001),但是也明显低于 MI+IgG 组大鼠血浆中去甲肾上腺素水平(17.101±0.490 pg/mL vs 21.047±1.358 pg/mL,p0.001)。以上结果表明,抑制中枢PVN内HMGB1的表达可降低MI后异常升高的外周交感神经活性。8.免疫组织化学方法检测结果显示Control组和Sham组大鼠中枢PVN内HMGB 1很少出现,与Control组和Sham组相比,MI+IgG组大鼠中枢PVN内HMGB 1阳性核的密度明显增高。而MI+Anti-HMGB1-Ab组大鼠中枢PVN内HMGB 1阳性核密度明显低于MI+IgG组。9.我们用Western Blot方法检测中枢PVN内HMGB1是否通过ERK信号通路参与调控MI后外周交感的激活。使用Image J软件进行WB条带恢复分析,并用目的蛋白灰度值/内参β-actin灰度值进行归一化处理,结果显示:MI+IgG组大鼠中枢PVN内HMGB 1蛋白水平显著高于Control组和Sham组(2.66±0.43 vs 0.77±0.12,p0.001;2.66±0.43 vs 1.08±0.23,p0.001),而 MI+Anti-HMGB1-Ab组大鼠中枢PVN内HMGB 1蛋白水平明显低于MI+IgG组(1.43±0.24vs 2.66±0.43,p0.001)。此外,我们还发现MI+IgG组大鼠中枢PVN内p-ERK的蛋白水平明显高于 Control 组和 Sham 组大鼠(1.81±0.45 vs 0.77±0.22,p0.001;1.81±0.45 vs 0.93±0.23,p0.001)。而经 Anti-HMGB1-Ab 治疗组大鼠中枢 PVN 内 p-ERK 蛋白的表达较MI+IgG组明显降低(1.30±0.23 vs 1.81±0.45,p0.001)。以上结果表明,AMI后可导致中枢PVN内HMGB1蛋白表达上调及ERK信号通路的激活,而给予HMGB1抑制剂Anti-HMGB1-Ab后,ERK信号通路的表达水平显著降低,说明中枢PVN内HMGB1对外周交感神经活性的调控是通过ERK信号传导通路完成的。研究结论:1.结扎大鼠左冠状动脉前降支制备AMI模型,可使AMI后大鼠中枢PVN内HMGB1的表达上调,并伴随着外周交感神经活性的增强和室性心律失常易感性的增加。2.在AMI发生后,经中枢PVN内微量泵注入Anti-HMGB 1-Ab,可以降低中枢PVN内HMGB1的表达,同时降低外周交感神经活性和室性心律失常易感性,为AMI后室性心律失常的防治提供新的治疗靶点。3.大鼠AMI后,中枢PVN内HMGB1对外周交感神经活性的影响可能是通过ERK信号传导通路完成的。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22
【图文】：

后肾,易感性,博士学位论文,山东大学

逦山东大学博士学位论文逦逡逑发率、易感性等方面的评分，以“均值±标准差”的形式体现其状况，ＭＩ＋ＩｇＧ组逡逑与假手术组相比，＊Ｐ＜0．邋０５；邋ＭＩ＋ＩｇＧ邋组与邋ＭＩ＋Ａｎｔｉ－ＨＭＧＢｌ－Ａｂ邋组相比，＃Ｐ＜０．邋０５。逡逑图５．邋ＡＭＩ后肾交感活性测定逡逑

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