MiR-762在心肌损伤中的作用研究

发布时间：2020-07-04 22:02

【摘要】：目的MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中具有调控功能的非编码RNA,目前对miRNAs在心肌损伤中的作用的研究很少。本课题主要探究了miR-762在心肌损伤中的作用。方法我们将小鼠原代心肌分为空白对照组和缺氧/复氧(A/R)处理的实验组,用高通量microRNAs基因芯片对收取的两组样品中的miRNA的表达谱进行差异性筛选。用qPCR对筛选出的miRNAs进行验证,并筛选出miR-762这个基因。采用缺氧/复氧(A/R)的处理对小鼠原代心肌细胞造成损伤后,使用qPCR检测miR-762在胞液和线粒体中的表达情况,并用荧光原位杂交技术和免疫共沉淀实验对其做出定位。设计与miR-762互补的化学修饰的antagomir以抑制内源miR-762和antagomir阴性对照(anta-NC)的表达,并经过A/R处理使心肌细胞受损,我们将其分为四组(对照,A/R,A/R+anta-NC,A/R+anta-762)。然后通过ATP含量、活性氧(ROS)水平、线粒体复合物活性和细胞凋亡等指标来检测心肌细胞受损时抑制miR-762的表达对心肌细胞和线粒体造成的影响。我们按照实验需要对小鼠进行了四组处理,antagomir以抑制内源miR-762和阴性对照(anta-NC)的表达,并采用心脏缺血再灌(ischemia/reperfusion,I/R)的方式建立小鼠心梗模型(Sham,I/R,I/R+anta-NC,I/R+anta-762)。然后收取正常的心脏组织和经I/R处理后的心脏组织,用qPCR检测miR-762在小鼠心梗后的表达情况,同时检测了线粒体复合物活性,细胞凋亡情况,心梗面积及心脏功能。结果(1)对miRNA基因芯片的结果进行分析并用qPCR验证后,我们发现与对照相比A/R处理后miR-762在线粒体中的表达明显升高。(2)miR-762主要定位于细胞质的线粒体中。(3)A/R处理会使原代心肌细胞受损并刺激miR-762的表达,而antagomir miR-762(anta-762)可以有效地抑制由心肌损伤引起的miR-762的表达。抑制miR-762的表达可以显著地抑制由A/R诱导的ATP的降低,抑制由A/R诱导的活性氧水平升高,抑制由A/R诱导的线粒体复合物活性的降低,并减少了心肌细胞的凋亡。(4)心脏缺血再灌(I/R)会使小鼠心脏受损甚至梗死,心梗区域的miR-762表达会升高。当抑制了miR-762的表达并对小鼠心脏进行I/R处理后,线粒体复合物I活性升高,细胞凋亡减少,心梗的面积减少,并且心脏功能恢复。结论我们通过A/R处理使小鼠原代心肌细胞受损,然后使用基因芯片筛选到了在受损的心肌细胞线粒体中高表达的miR-762这个分子。经过实验探究我们得出了以下的结论:(1)在受损的心肌细胞线粒体中miR-762的表达会显著升高。(2)抑制miR-762的表达可以显著地抑制由心梗导致的ATP的降低,活性氧水平升高,抑制心肌损伤造成的线粒体复合物活性的降低,并减少了心肌细胞的凋亡。(3)通过抑制miR-762的表达来恢复受损心脏中线粒体功能和心脏功能的新途径。这为治疗心梗等心脏疾病和线粒体相关疾病提供了一种新的治疗策略。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R542.22
【图文】：

1 MiRNA 芯片筛选结果图。原代心肌细胞随机分组为空白对照组和缺氧/复氧实验组，其中 miR-762 差异性最显著，P<0.05。R-762 在线粒体中的表达情况我们提取了正常情况下小鼠原代心肌细胞的总 RNA 和线粒体 RNA，用 miR-762 的表达量，发现线粒体中 miR-762 的表达占总 RNA 的一半多（明 miR-762 主要在线粒体中富集。将小鼠原代心肌细胞随机分为空白对 处理组进行培养后提取胞液和线粒体 RNA，同样用 qPCR 检测 miR-76况，结果发现经过A/ R处理后miR-762的水平是上调的，而且线粒体中m调十分明显（图 2B），这说明 A/ R 处理会引起线粒体中 miR-762 的水平

图 2 A. 小鼠原代心肌细胞的总 RNA 和线粒体 RNA，用 qPCR 检测 miR-762 的表达量。B.小鼠原代心肌细胞随机分为空白对照组和 A/ R 处理组进行培养后提取胞液和线粒体 RNA，用qPCR 检测 miR-762 的表达情况，P＜0.05，结果差异具有统计学意义。3 miR-762 在细胞中的定位将分离的原代心肌细胞铺片培养，48h 后将玻片取出进行荧光原位杂交实验。用 0.02 μM MitoTracker 将线粒体染为红色，用 LNATM microRNA 探针双 DIG 标记miR-762，通过用标记的核酸（LNA）探针进行荧光原位杂交来检测 miR-762，用DAPI 染细胞核，最后使用激光扫描共聚焦显微镜对荧光成像。我们发现 miR-762主要定位于胞质的线粒体中（图 3A）。将收取的原代心肌细胞，使用 Ago2 特异性抗体进行免疫共沉淀，并且用正常IgG 抗体作为阴性对照。免疫共沉淀最后收取的珠子，一半珠子用 100mM 甘氨酸洗脱结合的蛋白质，另一半用 TRIzol 分离 RNA。MiR-762 从细胞核中输出后会和 Ago2相结合，然后通过膜蛋白 Tom 进入线粒体中。实验结果发现细胞中有大量的 Ago2蛋白，且与阴性对照组相比Ago2组中miR-762表达水平特别高，这可以说明miR-762

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本文编号：2741655