Efp介导14-3-3η泛素化降解影响心肌细胞IPC保护作用

发布时间：2020-07-06 19:50

【摘要】：目的:心肌缺血预适应(Ischemic preconditioning,IPC)指的是长时间缺血前,先对心肌进行一至多次短暂性缺血,每次缺血后紧接着进行短暂性再灌注。IPC可提高心肌抵抗长时间缺血损伤的能力。本实验旨在探讨心肌细胞IPC作用中,雌激素效应环指蛋白(Estrogen responsive finger protein,Efp)是否与14-3-3η存在相互作用;上调或下调Efp表达水平对14-3-3η表达水平及其泛素化状态的影响,以及对IPC保护作用的影响。期许对IPC保护作用机制有进一步了解。方法:本实验采用H9c2心肌样细胞,构建缺氧预适应(Anoxic preconditioning,APC)模型、缺氧复氧(Anoxic/Reoxygenation,A/R)损伤模型。采用AD-Efp、AD-EfpRNAi重组腺病毒载体感染H9c2细胞,上调、下调Efp表达水平;Efp、14-3-3η和ubiquitin(ub)蛋白表达水平采用免疫印迹(Western blotting)法检测;免疫共沉淀(Co-ip)法检测Efp与14-3-3η是否存在相互作用,及上调或下调Efp表达水平对14-3-3η泛素化程度的影响;MTS法检测细胞存活率;分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;流式细胞仪检测细胞内活性氧水平(ROS)、线粒体膜电位稳定性(Δψm)及细胞凋亡水平,用于评价上调或下调Efp表达水平对心肌细胞APC保护作用的影响。结果:1.Control组、A/R模型预处理组、APC模型预处理组H9c2心肌样细胞蛋白裂解液与Efp或14-3-3η一抗孵育后可以检测到14-3-3η或Efp蛋白印迹。2.与APC组比较,APC+AD-Efp组14-3-3η蛋白表达水平明显下降(p0.01),APC+AD-Efp RNAi组14-3-3η蛋白表达水平明显上升(p0.01);与APC+AD-Efp组,加入蛋白酶体抑制剂MG-132显著上调14-3-3η蛋白表达水平(p0.01)。3.与APC+MG-132组比较,APC+AD-Efp+MG-132组14-3-3η蛋白泛素化程度显著加强。4.与APC组比较,APC+AD-Efp组细胞存活率显著下降,LDH活性显著上调,ROS生成量增多,线粒体膜电位(Δψm)稳定性显著下降,细胞凋亡水平明显上升(p0.01);APC+AD-EfpRNAi组细胞存活率显著上升,LDH活性显著下调,ROS生成量减少,Δψm稳定性显著上升,细胞凋亡水平明显下降(p0.01)。结论:在H9c2心肌样细胞中,Efp与14-3-3η存在相互作用。在H9c2心肌样细胞APC保护作用中,Efp介导14-3-3η发生泛素化及降解;上调Efp表达水平APC保护作用减弱,下调Efp表达水平APC保护作用增强,此作用结果可能与Efp对14-3-3η蛋白表达水平的影响有关。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2

【参考文献】