lncASAP2-7:1在颈动脉斑块稳定性中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-08 09:51

【摘要】：研究背景动脉粥样硬化相关的心血管疾病是目前全球各地区的第一死因,在西方国家,约有50%的人死于动脉粥样硬化相关疾病及其引起的并发症,而在多数医疗水平低下的国家,目前已经超越了感染性疾病的危害。动脉粥样硬化可导致多种临床表现,包括短暂性脑缺血发作(Transient cerebral ischemic attacks,TIA)、主髂动脉闭塞及冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease,CHD)等~([1])。虽然其临床症状多样,但病变本身具有普遍共性,即它们都表现为动脉管壁大量胆固醇酯的沉积及复杂的进展型斑块的形成,最终导致动脉相应供血区缺血性改变~([2])。颈动脉狭窄(carotid stenosis)因影响大脑血供而备受关注,其中90%由颈动脉粥样硬化引起,它能够引起颅内缺血并产生相应的临床症状,如黑蒙、视物模糊、偏瘫失语等,致残与致死率很高,患者一般无法自理,因而带来巨大的社会及经济负担。颈动脉狭窄通常起病隐匿,往往出现脑缺血症状后才被发现。目前普遍认为,导致脑缺血症状出现的原因主要有两个:一是动脉粥样硬化斑块不稳定,斑块破裂或表面继发的血栓脱落导致急性脑栓塞;二是动脉狭窄造成远端脑组织血流低罐注。近年来研究表明,斑块成分脱落是引起缺血性脑卒中最主要的原因,而颅内动脉低灌注导致卒中的较少~([3])。因此,研究颈动脉斑块稳定性,探索早期预测不稳定斑块的生物标记物及其作用机制具有重要意义,能够有效降低脑卒中等不良事件的发生。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度在200nt以上,不具备编码蛋白质功能的RNA。许多研究结果证实,多种lncRNA在血管疾病中发挥重要作用,在动脉粥样硬化性疾病的发生及进展中,lncRNA通过调节血管壁功能、激活巨噬细胞、调节脂质代谢及免疫炎症反应等多个环节调控疾病的发生与进展~([4])。但目前尚无明确报道lncRNA在颈动脉斑块稳定性中的作用及机制。研究目的我中心前期应用基因芯片的方法,得到了稳定及不稳定颈动脉斑块中差异表达的lncRNA及mRNA,其中lncASAP2-7:1差异表达倍数高,我们选择lncASAP2-7:1作为深入研究的靶标,下一步将验证lncASAP2-7:1在不同稳定性颈动脉斑块中的差异性表达,并检测斑块中lncASAP2-7:1含量与纤维帽厚度及脂质核心区等斑块主要成分的相关性。利用基因芯片结果进行生物信息学分析,预测lncASAP2-7:1的生物学功能,进一步通过细胞实验验证lncASAP2-7:1在调控血管平滑肌细胞功能中的作用及可能的作用机制,进而说明lncASAP2-7:1在斑块稳定性中发挥的调控作用。研究方法(1)临床样本研究:收集2015年8月至2016年12月年于海军军医大学附属长海医院住院行颈动脉内膜切除术(carotid endanerectomy,CEA)患者的颈动脉斑块标本。将收集到的颈动脉斑块标本切成小段分开保存,一部分标本液氮冻存用于取斑块中RNA,通过real time PCR验证基因芯片中lncASAP2-7:1差异性;一部分存放于福尔马林溶液中,然后石蜡包埋切片行HE染色,电镜扫判断斑块稳定性、测量纤维帽厚度及脂质核心区面积等。最后,统计分析斑块中lncASAP2-7:1相对表达量与斑块成分之间的相关性。利用基因芯片结果进行生物信息学分析,预测lncASAP2-7:1可能的生物学功能。医院伦理审查委员会评审并批准了此项研究,所有患者均知情同意。(2)细胞实验研究:包装lncASAP2-7:1过表达及干扰的慢病毒,通过慢病毒转染人主动脉平滑肌细胞,实验分组为lncASAP2-7:1上调组、上调对照组、下调组、下调对照组及正常空白对照组。采用细胞划痕实验检测lncASAP2-7:1调控血管平滑肌细胞的迁移功能,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定Ⅰ型胶原蛋白含量,进而反映lncASAP2-7:1调控血管平滑肌细胞合成分泌蛋白的功能,采用流式凋亡检测lncASAP2-7:1调控血管平滑肌细胞凋亡功能,CCK8(Cell Counting Kit-8)及流式细胞周期检测lncASAP2-7:1调控血管平滑肌细胞增殖功能。结果1.临床样本研究:收集2015年8月至2016年12月于长海医院血管外科行颈动脉内膜切除术的颈动脉斑块标本22例,其中不稳定斑块11例,稳定斑块11例。不稳定斑块lncASAP2-7:1相对表达量为6.679±5.883,稳定斑块lncASAP2-7:1相对表达量为1.192±0.583,Real-time PCR结果示lncASAP2-7:1在不稳定斑块中的相对表达量明显高于稳定斑块(p0.0001)。不稳定斑块纤维帽厚度为120.80±31.29μm,稳定斑块纤维帽厚度为163.51±34.34μm,不稳定斑块脂核所占比例为33.45%±9.76%,稳定斑块脂核所占比例为27.84%±7.38%。稳定斑块纤维帽厚度明显高于不稳定斑块(p0.01),两组斑块脂核所占比例无明显统计学意义。颈动脉斑块中lncASAP2-7:1相对表达量与纤维帽厚度存在负相关(r=-0.667,p0.01),与脂核所占比例无明显相关性(r=0.340,p0.05)。生物信息学预测结果示,lncASAP2-7:1可能参与了细胞迁移、分泌及细胞内蛋白质转运等生物学过程。(2)细胞实验研究:利用包装lncASAP2-7:1过表达及干扰的慢病毒干预人主动脉平滑肌细胞,分别验证了血管平滑肌细胞的迁移、分泌、增殖、凋亡功能,发现lncASAP2-7:1高表达可以明显抑制血管平滑肌的迁移及I型胶原蛋白的合成,在细胞增殖及凋亡中无明显作用。结论lncASAP2-7:1在不稳定斑块中表达量明显高于稳定斑块且与斑块中纤维帽厚度呈负相关,细胞实验证实lncASAP2-7:1高表达抑制了血管平滑肌细胞的迁移及分泌I型胶原蛋白的功能,影响了纤维帽的厚度,导致斑块不稳定,继发脑卒中等不良事件。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.4
【图文】：

颈动脉斑块,标本,血管平滑肌细胞,胶原蛋白

lncASAP2-7:1 在颈动脉斑块稳定性中的作用细胞、单核细胞等炎症细胞浸润），血管平滑肌细胞及胶原蛋白含块内出血、钙化程度及部位、斑块大小是否容易引起斑块不稳定[19]。

斑块,颈动脉斑块,核区,HE染色

集行 CEA 手术患者的颈动脉斑块标本（图 1 所示），结合上述不稳定斑标本 HE 染色行组织病理学分析（图 2 所示），筛选出 11 例稳定斑块，斑块，用于斑块成分测量及 real time PCR 验证 lncASAP2-7:1 差异表达量时选取狭窄程度最严重部位的切片，用 Caseviewer 软件测量斑块纤维核所占比例，纤维帽厚度取最薄处进行测量[7]（图 3 所示）。不稳定斑度为 120.80±31.29μm，稳定斑块纤维帽厚度为 163.51±34.34μm，不稳定占比例为 33.45%±9.76%，稳定斑块脂核所占比例为 27.84%±7.38%。所图 2 颈动脉斑块 HE染色定斑块，斑块中仅见较小面积的脂核区；(B)不稳定斑块，斑块内可见巨大）、斑块内出血（IPH）及表面血栓形成（T）； LC: liqid core, FC: fibtraplaque hemorrhage, T: thrombus

颈动脉斑块,成分测量

Real time PCR 验证 lncASAP2-7:1 差异性表P2-7:1 引物序列imer ACATTGTCTTAACCTCGTACTCTimer ACCGCTTATTCAGCCACACA果织病理学方法确定颈动脉斑块稳定性，分别选取 11 例稳进行 real time PCR 验证，以人 GAPDH 作为内参引物。实均值反应其相对表达量。图 3 颈动脉斑块成分测量图解域为脂质核心区面积（黄色方框内为测量值），箭头所指部位为纤框内为测量值）

【参考文献】