全新lncRNA在血管平滑肌细胞表型转换及心肌肥大中的作用和机制研究

发布时间：2020-07-08 15:55

【摘要】：背景:高血压是指动脉收缩压高于130mm Hg和(或)舒张压高于80mm Hg的综合征,是诱发卒中、冠心病、慢性肾病、心衰等多种并发症的重要危险因素,严重影响患者的生活质量并给国民经济造成了沉重的负担。高血压血管重构是引起上述并发症的关键病理始动因素,表现为继发于高血压后的血管内膜新生,中膜增厚,管腔狭窄,弹性降低。当高血压血管重构发生时,位于血管壁中层的平滑肌细胞出现表型转换,即从收缩态细胞表型转变为增殖迁移能力更强的增殖分泌态表型,血管平滑肌细胞表型转换同时也是导致血管瘤、动脉粥样硬化等血管疾病的核心病理基础,但其分子机制尚不明确。同时,高血压也是导致心衰的重要危险因素,随着心脏后负荷的增加,心肌细胞出现病理性肥大,失代偿后心脏收缩舒张功能紊乱最终导致心衰,而目前对于病理性心肌肥大的发生和分子机制的认识十分有限。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是近年来发现并得到广泛关注的一类非编码RNA。lnc RNA是指长度超过200nt的不编码蛋白质的RNA,种类繁多,功能多样,能够参与从转录到蛋白翻译后修饰的众多生物学过程中。lnc RNA在生物发育、疾病的发生中的必要作用逐渐得到揭示,在心血管系统中,lnc RNA在心脏发育、心肌再生、动脉粥样硬化、心肌肥大和心肌梗死等生理病理过程中的作用已有报道,但lnc RNA在高血压血管重构中的作用尚不清楚,而更多的参与心肌肥大的lnc RNA也有待研究。为此本课题分为两部分,通过lnc RNA表达谱芯片分别寻找到参与高血压血管重构和心脏后负荷增高诱导心肌肥大的lnc RNA,并深入研究其分子机制,探索其成为新的治疗靶点的潜能。第一部分lnc PSR通过其非编码转录本及编码Arteridin蛋白的双重作用促进血管平滑肌细胞表型转换方法:第一章:1.1使用lnc RNA-m RNA表达谱芯片检测24周龄自发性高血压大鼠(SHR)和正常血压对照大鼠(WKY)胸主动脉组织中差异性表达的lnc RNA,并使用q RT-PCR验证差异表达的lnc RNA。使用RT-PCR检测差异表达lnc RNA的组织表达特异性,重点关注血管组织特异性表达的lnc RNA Phenotype Switching Regulator(PSR)。使用lnc PSR RNA荧光原位杂交(FISH)分析lnc PSR在血管组织血管平滑肌细胞中的定位,并通过血管平滑肌细胞中FISH及核质分离检测lnc PSR亚细胞定位。1.2使用基因组生物信息学工具分析lnc PSR在大鼠、小鼠和人中的保守性,得到对应的序列信息。收集临床高血压血管重构肠系膜动脉标本,使用q RT-PCR验证人lnc PSR表达水平。1.3在血管平滑肌A10细胞中敲降lnc PSR,使用q RT-PCR及蛋白质免疫印迹(WB)检测收缩态蛋白(α-SMA,α-MHC,Calponin)表达的变化;使用CCK8和Ki-67染色实验检测敲降lnc PSR后A10细胞增殖能力的改变;使用细胞划痕实验和细胞小室Trans-well实验检测敲降lnc PSR后A10细胞迁移能力的改变。1.4构建lnc PSR全身敲除大鼠,使用颈动脉球囊损伤模型诱导在体血管平滑肌细胞表型转换,HE染色检测血管内膜新生水平,Ki-67染色检测血管平滑肌细胞增殖水平。第二章:2.1使用生物信息学工具分析lnc PSR中潜在的开放阅读框(ORF),并比较该ORF在大鼠、小鼠、人中的保守性,使用二级结构预测工具分析其可能的二级结构。2.2制作特异性抗体,在大鼠不同组织中检测潜在的蛋白表达,根据组织特异性将该蛋白命名为Arteridin。基于Arteridin序列构建带有标签蛋白的过表达载体,在HEK293细胞中验证表达能力。使用免疫荧光检测内源性Arteridin和过表达Arteridin在细胞中的定位。2.3使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Arteridin蛋白敲除大鼠,不影响lnc PSR转录本的表达,检测球囊损伤模型后新生内膜情况。将人Arteridin蛋白过表达于大鼠血管平滑肌细胞,检测Arteridin蛋白功能的保守性。使用人Arterdindin抗体,免疫组化检测高血压血管重构组织中Arteridin表达情况。2.4在大鼠血管平滑肌A10细胞中过表达lncPSR全长序列,qRT-PCR检测对收缩态蛋白转录的影响。通过过表达不同突变载体,q RT-PCR检测对收缩态蛋白转录的影响,明确lnc PSR的功能是来源于转录本还是Arteridin蛋白质。在A10细胞中过表达lnc PSR全长序列ATT突变质粒、Arteridin过表达质粒和si-lnc PSR,使用RNA-seq检测对血管平滑肌细胞转录组的影响,证实lnc PSR转录本及Arteridin蛋白质均能促进血管平滑肌细胞表型转换。第三章:3.1使用Arteridin免疫共沉淀(co-IP)结合蛋白质谱(LC-MS),在血管平滑肌细胞中寻找到Arteridin的结合蛋白YBX1,使用co-IP验证结合。依据YBX1功能结构域,构建YBX1功能结构域删除的过表达载体,使用co-IP明确YBX1具体哪个结构域负责与Arteridin结合。3.2使用腺病毒在大鼠血管平滑肌A7r5细胞中过表达Arteridin-FLAG和YBX1-HA,使用免疫荧光检测二者共定位,及Arteridin-FLAG过表达前后YBX1-HA细胞质细胞核分布的改变。使用WB检测Arteridin-FLAG过表达前后YBX1-HA细胞质细胞核分布的改变。3.3在A7r5细胞中分别使用si RNA敲降YBX1和用腺病毒过表达YBX1,使用q RT-PCR检测血管平滑肌细胞收缩态蛋白基因的表达;使用TGF-β刺激A7r5细胞后,使用q RT-PCR检测YBX1和lnc PSR m RNA水平的改变,看二者是否受同一信号通路调控;最后在A7r5细胞中过表达Arteridin-FLAG,同时敲降YBX1,明确Arteridin发挥功能是否依赖于YBX1。第四章:4.1在A10细胞、A10细胞过表达Arteridin-FLAG和大鼠胸主动脉组织中使用Arteridin抗体进行染色质免疫共沉淀DNA测序(Ch IP-seq)检测Arteridin结合的DNA。4.2使用双荧光素酶报告基因检测Arteridin对lnc PSR自身转录的调控。并使用q RT-PCR检测Arteridin-FLAG过表达后lnc PSR转录水平的改变。4.3使用RNA免疫共沉淀(RIP)检测lnc PSR转录本能否与Arteridin蛋白和YBX1-HA蛋白结合,以及YBX1结合lnc PSR的功能结构域。结果:第一章血管平滑肌细胞特异性lnc RNA PSR的发现鉴定及其在血管平滑肌细胞表型转换中的作用1.1 lnc RNA-m RNA表达谱芯片筛选出了在SHR和WKY大鼠胸主动脉中差异表达(p0.05,差异倍数1.2)的39条lnc RNA,通过q RT-PCR验证差异表达lnc RNA。RT-PCR电泳检测lnc RNA在不同组织表达,NR_027983(LOC680254基因)特异性表达于血管组织,作为候选我们将其命名为lnc RNA PSR。RNA FISH结合免疫荧光染色标记主动脉中层血管平滑肌细胞(α-SMA)和内皮细胞(v WF)发现lnc PSR主要分布于血管平滑肌细胞。在大鼠血管平滑肌细胞中,FISH和核质分离检测,发现lnc PSR在细胞核细胞质均有分布,更多表达于细胞质。1.2使用UCSC和ENSEMBL分析lnc PSR的物种间保守性,发现lnc PSR在小鼠(NR_027984)和人(NR_027982)中均有表达。q RT-PCR检测表明在高血压患者发生血管重构的肠系膜动脉中lnc PSR表达的升高。1.3 lnc RNA表达在4周和14周SHR大鼠胸主动脉组织中不升高,在24周龄SHR大鼠出现升高,即高血压稳定存在之后,提示lnc PSR可能参与了高血压血管重构。血管平滑肌细胞表型转换在血管重构中发挥重要作用,使用si RNA在大鼠胸中动脉A10细胞中敲降lnc PSR,q RT-PCR检测发现收缩态蛋白基因表达表达显著上升,WB检测显示蛋白水平也相应升高,提示血管平滑肌细胞收缩态表型得以维持。使用CCK8实验和Ki-67实验检测了lnc PSR敲降后,在基础状态下或PDGF-BB诱导细胞增殖条件下,A10细胞增殖水平降低。细胞划痕实验和细胞小室Trans-well实验,检测PDGF-BB诱导的细胞增殖,发现敲降lnc PSR后,A10细胞迁移能力减弱。1.4通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,我们构建了lnc PSR基因敲除大鼠,发现lnc PSR基因敲除大鼠使用颈动脉球囊损伤诱导的内膜新生显著降低,Ki-67染色提示血管平滑肌细胞的增殖水平下降。第二章lnc PSR转录本和其编码的Arteridin蛋白都能促进血管平滑肌细胞表型转换2.1在lnc PSR序列中发现了一段编码117aa的ORF,该ORF在小鼠中同样存在,在人中为一段106aa的ORF。2.2针对大鼠117aa ORF制作抗体,在大鼠不同组织中使用WB检测内源性表达,发现其在主动脉血管组织中特异性表达,分子量为12.9k Da,我们将这段蛋白命名为Arteridin。构建Arterdin带有FLAG或e GFP标签的过表达载体,使用WB检测在HEK293细胞中成功表达,而突变了ATG的载体没有表达。在大鼠胸主动脉A7r5血管平滑肌细胞中,使用免疫荧光检测Arteridin内源性表达和过表达后的细胞分布,发现Arteridin主要表达在细胞核中。2.3使用CRISPR/Cas-9基因编辑工具,我们在大鼠Arteridin起始密码子后插入T碱基形成提前的终止密码子,从而抑制了Arteridin表达而不影响lnc PSR本身的转录。使用颈动脉球囊损伤诱导内膜新生,与WT大鼠相比,Arteridin敲除大鼠中新生内膜显著降低。我们还将人的Arteridin过表达在大鼠A7r5细胞中,发现收缩态蛋白表达下降,提示Arteridin促进血管平滑肌细胞表型转换功能的保守性。使用针对人106aa的Arteridin抗体,免疫组化检测了高血压血管重构患者肠系膜动脉组织中Arteridin表达升高并定位于新生内膜中。2.4在A10细胞中过表达lnc PSR全长序列降低收缩态蛋白的表达,即促进了VSMCs表型转换。为了进一步明确该作用是来源于lnc PSR转录本还是Arteridin蛋白,我们设计了lnc PSR全长序列ATT突变、Arteridin重组蛋白等载体,发现过表达后均能降低收缩态蛋白的表达,表明lnc PSR转录本和Arteridin蛋白均能促进了VSMCs表型转换。最后我们使用RNA-seq在转录组层面证实了这一结论。第三章Arteridin蛋白通过结合YBX1促进血管平滑肌细胞表型转换3.1在Arteridin co-IP联合LC-MS蛋白质谱检测发现在A10细胞中,与内源性Arteridin和过表达的Arteridin结合信号最强的蛋白是YBX1,co-IP验证了二者的结合。人Arteridin和YBX1的结合同样存在,表明Arteridin与YBX1的结合具有保守性。构建YBX1功能结构域删除的过表达载体:YBX1-Del N-HA,YBX1-Del CSD-HA,及YBX1-Del C-HA,co-IP表明YBX1的C端结构域负责与Arteridin蛋白结合。3.2在A7r5细胞中使用腺病毒过表达了YBX1-HA,和Arteridin-FLAG,免疫荧光染色发现在单独过表达YBX1-HA时,YBX1主要分布在细胞质,而当同时过表达Arteridin-FLAG后,YBX1转位到细胞核,与Arteridin共定位形成核内的聚合体。WB检测细胞核和细胞质蛋白,验证了当Arteridin过表达后,YBX1从细胞质向细胞核的转位。3.3在A7r5细胞中单独使用si RNA敲降YBX1,使用腺病毒过表达YBX1,q RT-PCR检测收缩态蛋白基因表达的改变。发现当敲降YBX1后,α-SMA和Calponin表达上升;当过表达YBX1后,α-SMA和Calponin表达下降,这一结果与干预Arteridin一致。在A7r5细胞中过表达Arteridin-FLAG,同时敲降YBX1,逆转了Arteridin过表达对α-SMA和Calponin表达的抑制,表明Arteridin促进血管平滑肌细胞表型转换的作用是依赖于YBX1的。第四章Arteridin蛋白自身调控lnc PSR转录形成正反馈环路4.1在A10细胞中使用Arteridin抗体进行了染色质免疫共沉淀DNA测序(Ch IP-seq),发现Arteridin能够结合基因组DNA。而其中、Ch IP-seq中Arteridin能够结合lnc PSR基因启动子区域和第二外显子引起了我们的关注。4.2使用了双荧光素酶报告基因系统构建不同长度的lnc PSR启动子区域和第二外显子,发现Arteridin能够通过调控lnc PSR启动子223-666区段促进lnc PSR转录。在A10细胞中过表达Arteridin-FLAG和Arteridin过表达质粒均能升高lnc PSR m RNA水平。4.3在A10细胞中分别过表达Arteridin-FLAG,YBX1-HA以及YBX1删除功能结构域的质粒,使用RIP检测这些蛋白能否与lnc PSR结合,发现Arteridin和YBX1均能与lnc PSR结合,YBX1的CSD结构域及C端结构域参与结合lnc PSR。结论1.1 lnc PSR是特异性表达于血管平滑肌细胞的具有物种间保守性的lnc RNA,在血管平滑肌细胞表型转换中必不可少;1.2 lnc PSR能够编码一段物种间保守的血管组织特异性表达的蛋白质Arteridin,而lnc PSR通过其RNA转录本和Arteridin蛋白双重作用促进血管平滑肌细胞表型转换;1.3 Arteridin结合YBX1,促进YBX1核转位,Arteridin促进血管平滑肌细胞表型转换依赖于YBX1;1.4 Arteridin通过调控lnc PSR启动子区域,促进lnc PSR转录,形成“自身调控”正反馈环路。同时lnc PSR能够结合Arteridin及YBX1蛋白,是Arteridin-YBX1复合物的组成部分。第二部分lnc RNA Ahit通过结合SUZ12抑制MEF2A转录保护心肌肥大的相关研究方法:第一章:1.1使用lnc RNA-m RNA表达谱芯片检测小鼠主动脉横断面缩窄术(TAC)模型诱导心肌肥大2周后心脏组织中差异性表达的lnc RNA,并使用q RT-PCR验证差异表达的lnc RNA。依据组织表达特异性及差异表达倍数选出其中一个候选lnc RNA Ahit;使用生物信息学工具分析Ahit的物种间保守性和编码潜能;1.2在NRCMs心肌细胞中敲降和过表达Ahit,同时使用PE诱导心肌肥大,检测心肌细胞面积、心肌肥大相关基因的表达;1.3使用AAV9-sh RNA在小鼠体内心肌特异性敲降Ahit,检测其对TAC诱导的心肌肥大的影响,心脏重量、超声检测心功能、WGA染色检测心肌细胞面积、马松染色心肌纤维化。第二章:2.1在NRCMs细胞中敲降和过表达Ahit,q RT-PCR和WB检测邻近基因MEF2A的表达变化;2.2使用RNA FISH和核质分离检测Ahit亚细胞分布;使用cat RAPID预测Ahit与PRC2复合物中蛋白组分的结合;使用RIP和RNA pulldown验证Ahit与SUZ12的结合;2.3在NRCMs中使用Ch IP-PCR检测敲降Ahit后,SUZ12结合MEF2A启动子区域的改变以及H3K27me3结合MEF2A启动子区域的改变。结果:第一章lnc RNA Ahit的发现鉴定及其抑制心肌肥大的作用1.1使用lnc RNA表达谱芯片检测TAC 2周后小鼠心脏差异性表达的lnc RNA,并用q RT-PCR验证。其中lnc RNA 4833412C05Rik在TAC过后显著升高,我们将其命名为anti-hypertrophic interrelated transcript(Ahit)。Ahit具有物种间保守性,在人中的同源lnc RNA为LUNAR1,q RT-PCR检测发现LUNAR1高表达于高血压性心脏病患者的血清。1.2在NRCMs细胞中敲降Ahit会加重PE诱导的心肌肥大及心肌肥大相关基因(ANP,BNP,β-MHC等)的表达;而过表达Ahit,会抑制PE诱导的心肌肥大并降低心肌肥大相关基因的表达。1.3使用AAV9-sh RNA在小鼠心脏中敲降Ahit能够加重TAC诱导的心肌肥大、心功能损伤以及心脏组织纤维化。第二章Ahit结合SUZ12抑制MEF2A基因表达进而保护心肌肥大2.1在NRCMs及小鼠心脏中敲降Ahit,其邻近基因MEF2A表达升高。敲降Ahit同时敲降MEF2A,能够抑制心肌肥大和相关基因表达,提示Ahit促进心肌肥大依赖于MEF2A。2.2 RNA FISH及核质分离实验表明Ahit主要分布在细胞核。使用cat RAPID预测Ahit与PRC2复合物中SUZ12结合能力最强,通过RIP及RNA pulldown证明二者的结合。2.3 SUZ12 Ch IP-PCR表明,在NRCMs细胞中敲降Ahit后,SUZ12结合MEF2A启动子区域减弱;相应的MEF2A启动子H3K27me3水平也降低。结论:1.1 lnc RNA Ahit在TAC刺激后代偿性表达升高;1.2 Ahit能够抑制PE及TAC诱导的心肌肥大;1.3 Ahit通过结合SUZ12诱导MEF2A启动子区域H3K27me3,抑制MEF2A转录,进而抑制心肌肥大。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

陆军军医大学博士学位论文具体操作概括如下：1.3.2.1 测量前准备：在无人、安静、温暖的环境中，测量仪安装在实验台而不是地面上，提前 20-30 分钟让大鼠适应环境稳定下来，开机加热保温器，测量时避免空调出风口等位置。轻柔抓取大鼠，通过训练让每只大鼠适应套筒。1.3.2.2 鼠袋的使用：鼠袋鼠网要与动物大小相符合。打开鼠袋，将鼠网放入保温筒，再将保温筒放入鼠袋，将信号线置于鼠袋下合适的位置，把右侧 A 片从右往左包住保温筒，并将它固定在粘条 B 上。左手扶住鼠袋，前端朝下，右手将入口处的布片铺开。右手抓好大鼠，使其头部超前放入鼠袋，然后前端朝上，使用后侧布条交缠包裹固定大鼠臀部，暴露出完整鼠尾。（图 1-1）

陆军军医大学博士学位论文。A10 细胞使用 MOI 50 的慢病毒感染，转染时培养基加入 6 μg/mL polybrene 试剂高感染效率，加入病毒 24 小时后换液。培养 72 小时后，添加终浓度 10 mg/ml 的霉素用以筛选所有的被感染上的细胞（慢病毒感染细胞具有嘌呤霉素抗性），筛选后细胞传代、冻存，提 RNA 使用 q-PCR 检测稳转细胞系干扰效率。操作步骤如下（图 1-2）：

图 1-3 蛋白湿转 PVDF 膜“三明治”组装（4）固定好转膜电泳盒，向内槽中倒入 1×转膜液，液面盖过整个 “三明治”即可外槽加入双蒸水用于降温；整个转膜盒放在冰水浴中。（5）转膜条件：30V 常压，2 小时。1.3.19.4 抗原封闭：（1）10×TBS 配制 (1 L) ：24 g Tris base , 88 g NaCl , 900 mL 双蒸水溶解, 用 12Cl 调 pH 至 7.6 ，双蒸水补充至总体积 1 L。（2）封闭液配制：1×TBS 溶解 5% 脱脂奶粉。（3）1×TBST 洗膜液配制：1×TBS，0.1% Tween 20。（4）将膜放入封闭液中，摇床上，室温封闭 1 小时。（5）1×TBST 洗膜 3 次，每次 5 分钟。1.3.19.5 一抗孵育：

本文编号：2746748