心力衰竭中SERCA2a低表达的组蛋白乙酰化机制及干预研究

发布时间：2020-07-11 08:16

【摘要】：第一部分无呼吸机支持下微创小鼠主动脉弓缩窄心力衰竭模型的建立目的:主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)心力衰竭模型由于具有构建时间短、可重复性好等优点,广泛应用于压力超负荷所致心力衰竭的研究。以往多在气管插管机械通气下建立这一动物模型,但小鼠气管插管耗费时间较长,反复尝试容易造成气道损伤;且经典TAC手术创伤较大,小鼠死亡率较高。为了减少气道损伤和手术创伤导致的小鼠死亡,本研究拟采用不需气管插管,经面罩吸入麻醉及微创手术方式建立TAC模型,以降低模型构建过程中的小鼠死亡率。方法:1、3月龄c57小鼠为研究对象,分为假手术组、机械通气TAC组和非机械通气TAC组建立小鼠TAC模型。机械通气TAC组在气管插管机械通气下,采用经典TAC手术方式;非机械通气TAC组保留自主呼吸,采用微创TAC手术方式;假手术组同非机械通气TAC组,不同点在于手术过程中不对主动脉弓进行环缩;2、假手术组、机械通气TAC组和非机械通气TAC组小鼠术前及术后3天,利用高频超声检测主动脉弓直径、血流速度和压差;术前及术后4周,利用超声心动图心动图检测LVAWd、LVIDd及LVPWd并计算LVEF值;术后4周取小鼠左心室心肌组织,HE染色后使用显微镜对心肌超微结构进行观察;3、假手术组和非机械通气TAC组术前及术后8周利用超声心动图检测LVAWd、LVIDd及LVPWd并计算LVEF值,术后8周测量LW和BW,计算LW/BW值。结果:1、非机械通气TAC组操作时间为10.86±2.36分钟较机械通气TAC组24.44±3.55分钟明显减少(p0.05);小鼠存活率增加,两组分别为93.3%和73.3%(p0.05);2、假手术组、机械通气TAC组和非机械通气TAC组术前主动脉弓直径、血流速度和压差、LVAWd、LVIDd、LVPWd、和LVEF组间比较差异无统计学意义;术后3天或4周,机械通气TAC组和非机械通气TAC组上述指标比较差异无统计学意义(p0.05),而与自身术前及假手术组术后比较差异有统计学意义(p0.05);比较假手术组,机械通气TAC组和非机械通气TAC组心肌细胞增大(p0.05);3、术后8周非机械通气TAC组LVIDd 3.89±0.04 mm、LVEF45.07±4.19%与自身术前LVIDd 3.69±0.05 mm、LVEF 62.35±2.20%及假手术组术后LVIDd 3.71±0.04 mm、LVEF 61.93±2.28%比较差异有统计学意义(p0.05)。术后8周非机械通气TAC组LW/BW 8.15±0.58较假手术组的5.23±0.22升高55.8%。结论:1、无呼吸机支持下微创手术建立小鼠TAC模型可减少操作时间,提高小鼠生存率;2、术后8周,无呼吸机支持下微创手术可成功建立TAC心力衰竭模型。第二部分心力衰竭小鼠心脏SERCA2a低表达的组蛋白乙酰化机制研究目的:第一部分成功建立微创TAC心力衰竭小鼠模型,为其发生机制的研究奠定了基础。肌浆网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)是心脏重要的功能蛋白,在心力衰竭心脏中SERCA2a蛋白及其m RNA表达量明显降低,提示SERCA2a下降可能发生在其转录水平。组蛋白修饰可调控基因的转录和表达,研究发现组蛋白修饰可调控编码SERCA2a的基因ATP2a2的表达。课题组前期研究发现,心脏中HDAC1表达增加可降低组蛋白乙酰化水平。因此我们推测心力衰竭中心脏SERCA2a低表达可能与HDAC1介导的组蛋白低乙酰化有关。本部分研究以组蛋白乙酰化为切入点,探讨心力衰竭小鼠心脏SERCA2a低表达的组蛋白乙酰化表观遗传学机制。方法:第一部分术后8周获取的小鼠心脏组织做如下检测:1、利用Q-PCR检测SERCA2a m RNA和HDAC1 m RNA的表达水平;2、利用ChIP-Q-PCR检测Atp2a2启动子区域组蛋白H3、H3K4和H3K9乙酰化水平,HDAC1、GATA4和Mef2c的结合水平。结果:1、TAC组小鼠心肌SERCA2a m RNA表达水平显著低于假手术组(p0.05),HDAC1 m RNA表达水平显著高于假手术组(p0.05);2、TAC组小鼠心脏Atp2a2启动子区域组蛋白H3、H3K9乙酰化水平较假手术组低(p0.05),HDAC1的结合水平较假手术组增高(p0.05),Mef2c和GATA4结合水平较假手术组降低(p0.05)。结论:心力衰竭小鼠心脏Atp2a2启动子区域组蛋白H3K9乙酰化水平降低可能与HDAC1 m RNA表达增高有关,由此可引起转录因子GATA4及Mef2c与Atp2a2启动子区的结合减少,导致SERCA2a低表达,提示Atp2a2启动子区域组蛋白H3K9乙酰化可能参与SERCA2a表达调控。第三部分EGCG抑制HDAC1上调SERCA2a表达防治TAC小鼠心力衰竭目的:第二部分研究发现心力衰竭小鼠心脏SERCA2a表达显著降低,而HDAC1表达增高,引起Atp2a2启动子区组蛋白H3K9乙酰化水平降低,可能在其中发挥重要调控作用。本课题组前期研究发现EGCG可抑制HDAC1活性而上调组蛋白H3K9的乙酰化水平,因此EGCG选为本部分实验的干预剂,研究EGCG干预对TAC小鼠心脏SERCA2a低表达及心脏功能的影响,并探讨其可能作用机制。方法:以3月龄c57小鼠为研究对象,将其随机分为假手术组(SHAM组)、非机械通气TAC组(TAC组)、TAC+EGCG组和SHAM+EGCG,TAC+EGCG组和SHAM+EGCG组术后第一天开始连续给予腹腔注射EGCG 50mg/kg/d干预12周,SHAM组和TAC组注射生理盐水对照,然后进行后续实验:1、采用超声心动图评价小鼠心脏功能;2、Western blot及Q-PCR检测各组小鼠心肌SERCA2a蛋白及m RNA表达水平;3、检测各组小鼠心肌中HDAC1的活性;4、ChIP-Q-PCR检测ATP2a2启动子区域组蛋白H3、H3K4、H3K9乙酰化水平,HDAC1结合水平,转录因子GATA4、Mef2c结合水平。结果:1、术后12周TAC+EGCG组小鼠心脏LVIDd 3.80±0.13 mm、LVEF62.24±3.07%较术前LVIDd 3.73±0.09 mm、LVEF 63.01±1.79%无明显变化(p0.05);TAC组LVIDd 4.04±0.05 mm较术前3.73±0.09mm增大(p0.05),LVEF 41.37±7.79%较其术前62.99±1.81%降低(p0.05)。术后12周TAC+EGCG组LW/BW 5.29±0.09较假手术组的5.16±0.10差异无统计学意义(p0.05);TAC组LW/BW 8.51±0.25较假手术组升高64.9%;2、TAC+EGCG组SERCA2a蛋白和m RNA水平较TAC组表达水平增高(p0.05),与SHAM组比较无明显变化(p0.05);3、TAC+EGCG组Atp2a2启动子区组蛋白H3、H3K9乙酰化水平与TAC组相比增高(p0.05),GATA4和Mef2c结合水平与TAC组比较有增高(p0.05),与假手术组比较无统计学差异(p0.05);4、TAC+EGCG组HDAC1活性以及与Atp2a2启动子区结合水平较TAC组降低(p0.05),与SHAM组比较无统计学差异(p0.05)。结论:1、EGCG干预可以防治TAC小鼠心力衰竭的发生;2、EGCG干预可能通过抑制TAC小鼠心脏中HDAC1活性,降低其与Atp2a2启动子结合水平,引起SERCA2a启动子区域组蛋白H3K9乙酰化水平升高,促进对应转录因子GATA4和Mef2c与之结合,防止SERCA2a低表达。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.6
【图文】：

8 小鼠手术前后主动脉弓直径比较，*p<0.05，假手术组 n=8; 机械通气 TAC 手术组 n非机械通气 TAC 手术组 n=28。gure 8 Comparison of aortic arch diameter before and after surgery in mice, *p<0.05, nam operation group; n=22 in TAC with mechanical ventilation group; n=28 in TAC witmechanical ventilation group..4 小鼠主动脉弓血流速度及压差假手术组小鼠、机械通气 TAC 组和非机械通气 TAC 组小鼠术前主动脉速度及压差差别无统计学意义(p>0.05)；术后假手术组小鼠主动脉弓血流速差和术前比差别无统计学意义(p>0.05)；术后机械通气TAC组和非机械通气小鼠主动脉弓血流速度及压差两组之间比较差别无统计学意义(p>0.05)，和前比差别有统计学意义（p<0.05）。（见表 1、图 9）

图 9 小鼠手术前后主动脉弓血流速度及压差比较，*p<0.05，假手术组 n=8; 机械通气 TAC手术组 n=22; 非机械通气 TAC 手术组 n=28。Figure 9 Comparison of aortic arch blood flow velocity and pressure gradient before and aftersurgery in mice, *p<0.05, n=8 in sham operation group; n=22 in TAC with mechanicalventilation group; n=28 in TAC without mechanical ventilation group.2.1.5 超声心动图检测小鼠心脏功能利用超声心动图检测各组小鼠心脏功能。如表 2 所示，手术前机械通气 TAC组、非机械通气 TAC 组与假手术组三组小鼠心脏 LVAWd，LVPWd，LVIDd 和LVEF差异无统计学意义。手术后，机械通气TAC组和非机械通气TAC组LVAWd，LVPWd，LVIDd 和 LVEF 组间比较差异无统计学意义，两组分别与自身术前及假手术组术后比较上述参数差异有统计学意义（p<0.05）。

图 12 小鼠手术前后主动脉弓直径比较，*p<0.05， n=8。rison of aortic arch diameter before and after surgery in mice,表 4 手术前后小鼠主动脉弓超声参数比较ltrasound evaluation of aortic arch before and 3 days after opeSHAM (n=8) TAC (n=beforeoperation3 days afteroperationbeforeoperation1.51±0.10 1.56±0.03 1.47±0.04 820.93±41.98 925.94±102.00 910.38±56.56 282.70±0.28 3.47±0.77 3.32±0.40 sented as the mean ± SD. *, p<0.05 compared with before and operation in the each group by paired t test准差表示。*表示各组术前和术后 3 天采用配对 t 检验进行比弓血流速度和压差

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