循环外泌体miR-155调控S1PR1在风湿性心脏病发生发展中的关系研究

发布时间：2020-07-11 14:54

【摘要】：研究背景风湿性心脏病(Rheumatic heart disease,RHD)是A组溶血性链球菌感染后风湿热引起的自身免疫性疾病。该疾病主要累及二尖瓣,表现为瓣膜狭窄和关闭不全。RHD在我国仍有较高的患病率,是导致慢性心力衰竭及致死的主要心血管疾病之一。在感染链球菌后长期的慢性疾病发展过程中,心脏瓣膜组织是如何发生病变从而导致RHD发生的,目前确切机制并不明确,研究其致病机制并进一步寻找RHD的新干预靶点具有重要意义。研究目的构建RHD组大鼠模型,检测RHD大鼠及control组大鼠外泌体中miR-155的表达差异,检测两组瓣膜组织中磷酸鞘氨醇受体1(sphingosine1-phosphate receptor 1,S1PR1)的表达情况。初步探讨两组大鼠中循环外泌体miR-155和S1PR1表达差异,利用荧光素酶报告基因系统验证S1PR1与miR-155靶标的关系。研究方法:30只Lewis雌性大鼠随机化分为RHD组和control组,每组各15只。构建RHD大鼠模型:第1周,RHD组于足垫皮下注射0.2ml抗原Ⅰ(灭活GAS菌液:完全弗氏佐剂乳化剂=1:1)。给药间隔周期为7天,于第2周、3周、4周、5周腹部皮下注射0.5ml抗原Ⅰ。control组在同样时间点、同样剂量、同样部位注射无菌生理盐水+完全弗氏佐剂乳化剂。从第6周开始,RHD组予腹部皮下注射0.5ml抗原Ⅱ(灭活GAS菌液),给药间隔周期为7天,直至第28周造模结束,control组在同样时间点、同样剂量、同样部位注射无菌生理盐水。32周模型构建结束。造模结束后大鼠行经胸心脏彩超检查,在不同的切面对比两组大鼠左室射血分数(EF%)值、左室短轴缩短分数(FS%)值、E/A比值。造模结束后处死大鼠,大鼠血浆提取外泌体并鉴定其形态,提取外泌体总RNA行荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测两组大鼠血浆外泌体中miR-155的表达情况,部分大鼠心肌及二尖瓣瓣膜组织行HE染色、Masson染色,部分二尖瓣瓣膜组织行免疫蛋白印迹(Western blot,WB)、PCR检测S1PR1的表达情况。同时利用生物信息学的方法在线预测miR-155与S1PR1的结合位点,构建含有结合位点的S1PR1的3'UTR突变型质粒,将重组质粒与miR-155和miR-NC共转染293T细胞,通过过表达miR-155后,检测荧光素酶活性变化,定量反映miR-155对S1PR1的抑制作用。研究结果1、造模过程中,RHD组大鼠死亡2只,control组大鼠死亡0只;2、造模结束后RHD组大鼠EF%为55.06±6.56,control组大鼠EF%为77.80±5.97,P值0.05,差异有统计学意义;RHD组大鼠FS%为23.60±3.90,control组大鼠FS%为39.83±5.60,P值0.05,差异有统计学意义;RHD组大鼠E/A比值为0.72±0.12,control组E/A比值为1.56±0.18,P值0.05,差异有统计学意义。3、瓣膜组织HE染色结果示,RHD组中有3只大鼠存在心肌炎症细胞浸润;RHD组中有10只大鼠二尖瓣瓣膜组织存在慢性淋巴细胞、浆细胞浸润,出现胶原蛋白增生、钙盐沉积及血管新生等现象。RHD组大鼠瓣膜炎比例占76.9%(10/13);control组二尖瓣瓣膜组织未发现炎症细胞浸润。4、Masson染色结果示,control组染色呈现淡蓝色,胶原纤维无明显增生现象;RHD组染色明显加深,胶原纤维增生明显,排列紊乱。5、RHD大鼠循环外泌体中miR-155表达量较control组大鼠的表达量高,p0.05,差异具有统计学意义。6、在mRNA基因水平及蛋白水平,RHD组大鼠瓣膜组织中S1PR1表达量较control组均下降。7、与共转染S1PR1-3'UTR和miR-NC组相比,共转染S1PR1-3'UTR和miR-155组荧光素酶活性下降明显,P0.05。研究结论RHD大鼠循环外泌体中的miR-155表达升高,瓣膜组织中S1PR1表达量下调;miR-155可能靶向S1PR1表达参与RHD的发生发展过程。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R541.2
【图文】：

外泌体 miR-155 调控 S1PR1 在风湿性心脏病发生发展中的关系研究 硕士学位实验结果模结果 一般情况RHD 组大鼠第一次足垫注射抗原抗原Ⅱ后，出现足部发红肿胀，皮高，灵活性变差，活动量减少等现象。关节肿胀至第 4 周开始逐渐消 7 周完全消退，未留下关节畸形。造模过程中，大鼠死亡 2 只，造模时，余 13 只大鼠。control 组大鼠同样出现足部发红肿胀，注射部位皮温增高，大鼠活减少，食欲、精神减退。足部红肿于第 2 周开始逐渐消退，第 4 周完退，未留下关节畸形。造模结束时，余 15 只大鼠。b ca7w4w1w

图 2-1 miR-155-5p 与 S1PR1 的 3' UTR 存在特异性结合的位点Figure 2-1 Regions where miR-155-5p specifically binds to the 3' UTR of S12.各组细胞间荧光素酶活性的变化表 2-1 各组 luciferase 相对表达量Table 1-1 Relative expression of luciferase in each group3. 将 UTR-NC 组量化为 1 后，比较在相同的 miRNA 的作实验分组 荧光素酶活性变化（x±S实验组 1 1.00±0.06实验组 2 1.13±0.07实验组 3 1.00±0.03实验组 4 0.88±0.07实验组 5 1.00±0.01实验组 6 1.29±0.03阳参 miRNA NC 组 1.00±0.03阳参 miRNA 0.49±0.01

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