可溶性Corin对心力衰竭的治疗作用

发布时间：2020-07-14 23:38

【摘要】：研究目的:心力衰竭是各种心血管疾病导致心功能不全的一种综合症,严重威胁人类的健康。尽管近年来在心衰诊疗方面取得了一些进展,但心衰仍然有较高的发病率和死亡率,因此研制新型心衰治疗药物具有重要意义。Corin是一种主要表达于心脏的跨膜丝氨酸蛋白酶,可将心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)前体转化为ANP,发挥调节血压、维持心脏形态、改善心功能的作用。我们课题组研究发现,心衰患者血浆中Corin水平显著降低,且Corin水平降低程度与心衰的严重程度相关。最近许多报道也表明,在急性心肌梗死、冠心病、心衰和中风患者中,血浆可溶性Corin水平显著低于正常人。这些研究提示Corin缺乏或功能缺陷可能参与心衰等心血管疾病的发生发展。在本研究中我们用分子生物学、细胞生物学及生物化学方法,表达获得大量的可溶性Corin蛋白,并利用小鼠心衰模型探讨可溶性Corin对心衰的治疗作用。研究方法:1.以pSEC-EKsolCorin质粒为模板克隆EKsolCorin-V_5/His片段,插入至pMH3表达载体,用该重组表达载体转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定克隆株。2.收集含Corin的细胞表达上清,通过Ni柱亲和层析纯化并经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及蛋白质免疫印迹法(Western blot)鉴定蛋白纯度。3.在体外,用肠激酶EK活化重组可溶性Corin蛋白,用Western blot检测有无~40 kDa的Corin活化条带,判断Corin是否能够被活化。4.将pro-ANP上清和活化的可溶性Corin 37°C孵育30 min后,刺激BHK细胞,通过Western blot以及cGMP ELISA试剂盒检测pro-ANP是否被转化为ANP,BHK细胞内cGMP是否升高,判断Corin在体外有无生物学功能。5.结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心衰模型,术后1周采用心脏超声技术对心衰小鼠进行心功能评价,取小鼠心脏进行HE、Masson染色观察心肌组织结构。6.用心衰小鼠评估可溶性Corin的疗效。术后一周,给模型小鼠腹腔注射活化的可溶性Corin,心超监测小鼠在术前1天、术后7、14、21、28天等不同时间点的心功能指标。实验结束后,用Masson染色对心脏进行组织学分析。研究结果:1.构建了可溶性Corin的真核表达载体pMH3-EKsolCorin,转染CHO细胞获得高效稳定表达EKsolCorin的细胞株。2.镍柱亲和层析纯化的重组蛋白EKsolCorin纯度达90%。3.纯化的EKsolCorin可被肠激酶激活。4.活化的可溶性Corin可将pro-ANP转化为ANP,提示Corin在体外具有生物学功能。5.心脏超声检测显示心梗模型组小鼠心室明显扩大,心室壁厚度明显变薄,心室收缩功能与舒张功能均显著下降(p0.001)。HE和Masson染色可见心梗模型组小鼠心脏有明显的梗死区。6.与PBS组相比,活化的可溶性Corin治疗心衰小鼠后,可显著改善小鼠的心功能,心室收缩功能与舒张功能均显著增加(p0.01)。结论:综上所述,我们表达纯化了可溶性Corin,并在体外进行了蛋白纯度及生物活性鉴定,最后运用小鼠心梗模型研究活化的可溶性Corin对心衰小鼠的治疗作用。研究结果显示获得的可溶性Corin具有生物学活性,能改善心衰小鼠的心功能,提示可溶性Corin可作为心衰治疗的新策略。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R541.6
【图文】：

Corin的蛋白结构模式图

Corin的合成、转运及活化过程

WTCorin和可溶性Corin在CHO细胞中的表达A：WTCorin蛋白模式图；B：Westernblot检测Corin蛋白在CHO细胞裂解液中的表达与活化；C：Westernblot检测Corin蛋白在CHO细胞上清中的表达与活化

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本文编号：2755652