二氧化硅纳米颗粒介导的microRNA-24转染对心肌细胞凋亡的影响

发布时间：2020-07-17 23:43

【摘要】：目的:利用聚乙烯亚胺(PEI)对二氧化硅(Silica)表面功能化修饰,形成功能化二氧化硅纳米材料载体(F-Silica),再通过静电吸附作用与miR-24结合形成基因载体复合物F-Silica-miR-24。在体外实验研究中评估其对新生大鼠心室肌细胞(NRVM)的毒性及转染效率,并筛选出最适配置比例。进一步研究其对促凋亡蛋白Bim的表达及氧化应激损伤后心肌细胞凋亡的影响。方法:1)构建F-Silica,利用透射电镜、纳米粒度及Zeta电位分析仪表征材料的微观结构、粒径大小及携带电荷。2)通过CCK-8/live-dead染色等评估F-Silica的生物相容性,琼脂糖凝胶电泳筛选出基因复合载体F-Silica-miR-24最适配置比例。3)细胞摄取研究评估F-Silica-miR-24基因转染效率。4)实验分为6组:空白对照组(NC组)单纯加入100?l PBS;H_2O_2组单纯加入终浓度为100?mol/L H_2O_2处理24 h;miR-24类似物(miR-24-mimics)组;miR-24类似物对照(miR-24-mimics NC)组;miR-24抑制剂(miR-24-inhibitor)组;miR-24抑制剂对照(miR-24-inhibitor NC)组在H_2O_2处理前预先加入F-Silica搭载的200 nM寡核苷酸预转染24 h。体外转染后通过荧光定量PCR、Western blotting等评估其对新生大鼠心室肌细胞目的基因及促凋亡蛋白Bim的作用,TUNEL染色进一步评估其对心肌细胞凋亡的影响。结果:1)合成的Silica尺寸集中分布在40-60nm之间;当Silica与DSP-PEI按照质量比为1:1来构建基因载体F-Silica时携带+21mv左右电位。2)F-Silica浓度为0.25mg/ml时可完全荷载200nM的miR-24,作为后续实验F-Silica-miRNA组中F-Silica的终浓度;且当以荷载miRNA所需浓度2倍剂量与心肌细胞共培养1d/3d时对心肌细胞的活力均无明显影响。3)细胞摄取研究清楚地证明F-Silica-miRNA复合纳米载体可以有效地将miRNA分子递送到心肌细胞中,经计数转染效率可达80%以上。4)以100uM H_2O_2作用24h后心肌细胞存活率在50%左右,心肌细胞凋亡模型建模成功;荧光定量PCR结果示:与NC组相比,H_2O_2组、miR-24 mimics NC组、miR-24 inhibitor NC组中心肌细胞内miR-24表达量均降低,差异均有统计学意义(P0.05);miR-24 mimics组中miR-24的表达量显著提高,miR-24 inhibitor组中miR-24的表达量显著降低,差异均有统计学意义(P0.05)。Western blotting结果示:与NC组相比,H_2O_2组、miR-24 inhibitor组中蛋白Bim的表达量明显提高,差异均有统计学意义(P0.05),而NC组与miR-24 mimics组中蛋白Bim的表达量无统计学差异(P0.05)。TUNEL染色结果表明通过体外过表达miR-24可以抑制心肌细胞凋亡,促进心肌细胞存活;抑制miR-24的表达,则心肌细胞凋亡发生率显著提升。结论:1)选用PEI800作为二氧化硅表面修饰物,合成的Silica经DSP-PEI功能化后(W/W为1:1)生成的纳米基因载体F-Silica不仅生物相容性较好且基因转染能力更强。2)相比于H_2O_2组,miR-24 mimics组中miR-24的表达量显著提高,并可显著抑制促凋亡蛋白Bim的表达。3)F-Silica介导的miR-24转染可以显著抑制氧化应激损伤导致的心肌细胞凋亡,促进心肌细胞存活。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54

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本文编号：2760088