多不饱和脂肪酸代谢产物在动脉粥样硬化发生发展中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-18 13:19

【摘要】：目的和内容:动脉粥样硬化是一类常见的心血管疾病,由低密度脂蛋白滞留在血管易损部位引发的不良性炎症反应所致,参与炎症反应细胞主要涉及血管内膜内皮细胞、中膜平滑肌细胞以及巨噬细胞。但目前动脉粥样硬化的治疗手段有限,主要通过他汀类降血脂药物加速低密度脂蛋白胆固醇的清除,如不加以控制,脂纹发展到后期形成易损斑块,将大大增加心肌梗死的风险,诱发心血管事件。饮食中富含的多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)主要分为ω-6和ω-3 PUFA,其中花生四烯酸(arachidonic acid,ARA)是ω-6 PUFA的代表,可以被环氧化酶途径(cyclooxygenase,COX)、脂氧合酶途径(lipoxygenase,LOX)或细胞色素P450途径(cytochrome P450,P450)代谢生成小分子活性物质,有研究表明P450途径的代谢产物环氧化二十碳三烯酸(epoxy-eicosatrienoic acid,EETs)具有抗炎和保护心血管作用,但是EETs在体内能够被可溶性表氧化物水解酶(Soluble epoxide hydrolase,sEH)水解,生成无保护作用的二羟二十碳三烯酸(Dihydroxy-eicosatrienoic acids,DHETs),所以抑制sEH酶活性有可能成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。同样ω-3 PUFA有着广泛的心血管保护作用,而ω-3 PUFA也能经ω-6 PUFA三条代谢途径生成小分子活性物质,但这些代谢产物在动脉粥样硬化发生过程中的作用及机制还未被阐明,同样有可能成为抗动脉粥样硬化的靶点。方法和结果:第一部分我们主要观察敲除sEH基因或药物抑制酶活性后对动脉粥样硬化发生发展的影响。LDLR~(-/-)和LDLR~(-/-)-sEH~(-/-)小鼠为模型,以正常饮食(chow diet,CD)为对照组,处理组为西方饮食(western type diet,WTD),其中一组LDLR~(-/-)小鼠在WTD喂养同时给予sEH抑制剂tTUCB,6周后取材评价动脉粥样硬化病情。我们发现基因敲除或药物抑制sEH后显著减少主动脉病灶面积,主动脉根部流出道斑块面积及斑块中巨噬细胞浸润数目减少,血脂水平得到改善。检测血浆中EETs和DHETs浓度,发现基因敲除或药物抑制sEH酶活性后,小鼠血浆中EET/DHET值增加。为进一步探讨EETs水平增加对巨噬细胞的影响,我们将LDLR~(-/-)和LDLR~(-/-)-sEH~(-/-)小鼠骨髓细胞移植到铯源照射过的LDLR~(-/-)小鼠体内,WTD喂养6周。我们发现移植LDLR~(-/-)-sEH~(-/-)骨髓细胞后,小鼠斑块面积显著减少,且通过荧光珠子标记方法发现斑块中Ly6C~(hi)单核细胞比例明显减少,提示EETs对单核细胞的粘附功能可能有影响。体外实验我们发现小鼠单核细胞中sEH被敲除或药物抑制酶活性后可以增加细胞内EET/DHET值,在转录水平上降低PSGL1的表达,并减少PSGL1介导的粘附作用。第二部分我们研究ω-3 PUFA在动脉粥样硬化发生发展中的作用。以LDLR~(-/-)为模型,WTD为对照组,处理组在WTD基础上添加高纯度深海鱼油(WTD+ω-3)。由于高等哺乳动物不能将ω-6 PUFA转化为ω-3 PUFA,而线虫中存在一种脂肪酸去饱和酶fat-1,具有将ω-6 PUFA及其代谢产物转化称ω-3PUFA及其代谢产物的功能,于是我们构建线虫fat-1基因与LDLR~(-/-)杂交小鼠(LDLR~(-/-)-fat-1~(tg)),观察内源性增加体内ω-3 PUFA对动脉粥样硬化的影响。WTD喂养6周后,我们发现补充ω-3 PUFA或转入fat-1转基因都可以显著减少WTD诱发的动脉粥样硬化斑块形成,增强斑块稳定性。实时定量PCR分析血管炎症基因表达水平,发现ω-3 PUFA的增加能够显著抑制血管炎症基因上调,通过抑制内皮细胞激活,减少血中单核细胞浸润到血管内膜。进一步我们采用UPLC-MS/MS分析小鼠现血浆中PUFA代谢谱,发现二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)的P450通路代谢产物18-羟化二十碳五烯酸(18-hydroxy-eicosapentaenoic acid,18-HEPE)和17,18-环氧化二十碳五烯酸(17,18-epoxy-eicosatetraenoic acid,17,18-EEQ)的水平在ω-3 PUFA补充组和fat-1转基因组都显著升高。在体外实验中,18-HEPE和17,18-EEQ预处理人脐静脉内皮细胞,能够抑制NF-κB信号通路,降低肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNFα)促发的炎症基因表达,同时能够减少单核细胞粘附到内皮细胞。结论:在WTD诱导的LDLR~(-/-)小鼠模型中,基因敲除或药物抑制sEH活性能够增加小鼠体内EETs水平,通过降低单核细胞中PSGL1基因的表达,减少对血管壁内皮细胞的滚动和粘附,进而缓解动脉粥样硬化病情;同时我们也发现内源性或外源性增加小鼠体内ω-3 PUFA水平能阻碍动脉粥样硬化的发生,主要是依赖EPA P450通路的代谢产物18-HEPE和17,18-EEQ,使内皮细胞的激活减少,缓解血管炎症。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5
【图文】：

士学位论文 实验结果 sEH 在动脉粥样硬化中的作用及机制敲除或药物抑制缓解动脉粥样硬化的发生发通过给予 LDLR-/-小鼠西方饮食诱导动脉粥样硬化，（tTUCB）的方法抑制小鼠 sEH 的酶活性，设置分予正常饮食、西方饮食或西方饮食+sEH 抑制剂（鼠给予正常饮食或西方饮食，喂养 6 周，实验过程中

津医科大学博士学位论文 结由于 LDLR-/-小鼠给予正常饮食喂养不会诱发动脉粥样硬化，只有在 W件下才会诱发主动脉产生粥样硬化，同时其主动脉根部瓣膜形成斑块。通较 LDLR-/-CD 和 WTD 两组，我们发现 WTD 组主动脉病灶面积明显增加，模型成功，同时敲除 sEH 基因或药物抑制 sEH 活性可以缓解动脉粥样硬化，减少主动脉病灶面积（图 1.2）。

天津医科大学博士学位论文 结果1.2 sEH 基因敲除或药物抑制改善小鼠血脂水平由于血脂水平是诱发动脉粥样硬化的主要因素，所以我们首先检测小鼠血总胆固醇（triglyceride, TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotecholesterol, LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterHDL-C）。结果显示，经 6 周 WTD 饮食后，LDLR-/-小鼠的 TC 和 LDL-C 显著高（图 1.3A&B），HDL-C 水平显著降低（图 1.3 C）；而给予 sEH 抑制剂或基敲除 sEH 后能显著抑制 WTD 诱发的血脂升高，同时升高 HDL-C 水平。

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本文编号：2760939