远端缺血预处理诱导外泌体递送miR-24减轻心肌缺血再灌注损伤及机制

发布时间：2020-07-21 10:11

【摘要】：背景:缺血性心脏病(Ischemic heart disease,IHD)是全球范围内人类最主要的致死病因,同时IHD耗费医疗资源惊人。美国最新数据显示,其住院及门诊ST段抬高心梗病人人均费用分别为24.5万美元和12.9万美元。通过溶栓、PCI等治疗手段尽快恢复血流供应是挽救患者生命的关键,但令人遗憾的是,血运重建在避免直接致死后果的同时又可引发心肌继发性的损害——缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)。动物实验研究显示将近50%的坏死心肌是由于再灌注损伤所引起,临床研究也表明缺血再灌注损伤会引发严重的心律失常并加重心肌损伤,严重影响预后。因此有效的防治IRI是治疗IHD亟待解决的重要临床问题。研究发现,在心脏致死性缺血前,给予远离心脏的肢端多次短暂缺血刺激,可以大幅减少实验动物的心肌梗死面积,这一现象被称为远端缺血预适应(Remote ischemic preconditioning,RIPC)。然而RIPC调控因子及其机制非常复杂,深入探讨RIPC心肌保护因子及其机制具有重要的意义。外泌体(exosome)是一种近年才引起关注的内源性颗粒,它是由细胞内多囊泡体与细胞膜融合而释放到细胞外的囊泡状小体,直径30~120nm。外泌体曾一度被认为是没有生物活性的细胞碎片,但后续研究证实不同细胞来源的外泌体可以携带不同的生物活性分子,如蛋白质、m RNA、mi RNA等,充当细胞间信息交流的中介,参与调节多种细胞生物学功能。生理状态下的细胞可以释放少量的外泌体,而在一定的内、外刺激(如信号通路激活、应激等)情况下,可以诱发细胞分泌大量的外泌体。缺血缺氧对机体组织器官而言是巨大的刺激,多种细胞都因此而分泌外泌体,这些外泌体首先进入周边细胞外液,并最终汇聚于血液循环中。外泌体是有着双层膜结构的带负电荷(-26m V)的微粒,并表达CD63等表面分子,这些特性使得它易于被IRI心肌细胞摄取吸收,并递送其携带的生物活性分子。有研究证明外泌体介导了缺血预适应对缺血再灌注损伤的保护机制,但是具体机制不明确。我们前期结果显示经过远端缺血预处理后的外泌体中mi R-24的含量明显上升,而mi R-24能够通过下调促凋亡蛋白Bim的表达减轻心肌细胞的凋亡。综上所述,我们推测RIPC后远端缺血区释放大量的外泌体入血,这些携带高浓度mi R-24的外泌体随血液循环至再灌注的心脏内,被IRI心肌细胞摄取吸收,mi R-24在心肌细胞内下调靶蛋白Bim的表达,减轻心肌细胞凋亡,减少缺血再灌注损伤。为了证实这一推测。我们将进行以下研究:首先,通过建立大鼠远端缺血预适应模型,提取远端缺血预处理后大鼠血浆中的外泌体,验证外泌体的纯度及浓度,并进一步检测外泌体中相关mi RNA的表达情况。其次,在体外实验中使用过氧化氢处理的方法建立氧化应激损伤的细胞模型,并观察远端缺血预适应诱导的外泌体是否能够减轻细胞的氧化应激损伤及其相关机制研究。最后,建立大鼠的缺血再灌注损伤模型,将经过远端缺血预适应的外泌体注射至心肌中,验证是否能够减轻大鼠心脏心脏缺血再灌注损伤,改善心功能。第一部分远端肢体缺血预适应模型的建立及外泌体的提取与鉴定目的:建立远端缺血预适应模型,提取外泌体并明确外泌体中相关mi RNA的表达水平。方法:1)用止血带结扎大鼠双后肢的方法建立大鼠远端缺血预适应模型,运用激光多普勒血流仪验证模型建立是否成功。2)采集经远端缺血预适应诱导前后大鼠血浆中的外泌体,WB检测外泌体表面标记蛋白CD63、CD9及CD81等表达情况,并运用透射电镜检测外泌体的形态及大小。3)纳米颗粒跟踪分析仪检测缺血预适应诱导前后血浆中外泌体的浓度变化,并用RT-PCR方法检测缺血预适应诱导前后血浆中外泌体中相关mi RNA的表达水平。结果:1)激光多普勒血流仪结果显示大鼠的双后肢经过止血带结扎后,大鼠双后肢的血流量明显下降(P0.05)。2)WB结果显示血浆外泌体表面标记蛋白CD63、CD81及CD9均有表达,而且与正常大鼠血浆的外泌体相比,经过远端缺血预适应诱导后的外泌体上述表面标记蛋白的表达水平明显上升(P0.05)。透射电镜结果显示外泌体的形态呈杯口状,直径在100 nm左右。3)纳米颗粒跟踪分析仪结果显示与远端缺血预适应前相比,经过远端缺血预适应处理后的外泌体数量明显上升(P0.05)。4)RT-PCR结果显示,与远端缺血预适应前相比,经过远端缺血预适应处理后的外泌体中mi R-24的表达水平明显升高(P0.05)。结论:1)成功建立大鼠远端缺血预适应模型。2)经过远端缺血预处理后大鼠血浆中的外泌体不但数量明显上升,而且外泌体中的mi R-24的表达水平也明显上升。第二部分:远端缺血预处理诱导外泌体递送mi R-24减轻H9c2细胞氧化应激损伤目的:本研究拟建立H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型,从离体实验探讨远端缺血预处理诱导的外泌体对氧化应激损伤的H9c2细胞的效应机制。方法:1)给予100m M H2O2处理H9c2细胞6 h建立细胞的氧化应激损伤模型,利用流式细胞仪、WB等方法检测细胞的凋亡水平,并用RT-PCR检测mi R-24的表达水平。2)使用Lipo3000分别将mi R-24 mimic、mi R-24 inhibitor及两组的空载组转染H9c2细胞,然后再给予H2O2处理。实验分成以下六组:Control组、H2O2treated组、H2O2 treated+mi R-24 mimic组、H2O2 treated+mi R-24 mimic negative control组、H2O2 treated+mi R-24 inhibitor组及H2O2 treated+mi R-24 inhibitor negative control组。利用流式细胞仪检测上述各组细胞的凋亡情况,并运用WB检测促凋亡蛋白Bim及cleaved-caspase-3的表达情况。3)分别将远端缺血预适应前后采集大鼠血浆中的外泌体加入到经过H2O2处理的H9c2细胞中,实验分为以下六组:Control组、H2O2 treated组、H2O2treated+EXO组、H2O2 treated+RIPC-EXO组、H2O2 treated+RIPC-EXO+mi R-24inhibitor组及H2O2 treated+RIPC-EXO+mi R-24 inhibitor-NC组。然后用流式细胞仪及Tunel等检测方法检测上述各组细胞的凋亡情况,用WB检测促凋亡蛋白Bim及cleaved-caspase-3的表达情况,并同时检测各组mi R-24的表达水平。结果:1)H2O2处理后的H9c2细胞凋亡发生率明显上升(P0.05),且H9c2细胞中mi R-24表达水平明显下降。2)与H2O2 treated组相比,H2O2 treated+mi R-24 mimic组H9c2细胞存活率明显增加(P0.05),流式细胞仪检测结果显示细胞的凋亡率明显下降(P0.05),WB检测到Bim及cleaved-caspase-3凋亡蛋白的表达水平明显下降(P0.05),而H2O2 treated+mi R-24 inhibitor组H9c2细胞存活率明显降低(P0.05),WB检测到Bim及cleaved-caspase-3促凋亡蛋白的表达水平明显上升(P0.05),流式细胞仪检测结果显示细胞的凋亡率明显上升(P0.05)。3)与H2O2 treated组相比,H2O2 treated+EXO组H9c2细胞的存活率及细胞凋亡率没有明显变化(P0.05),mi R-24的表达水平未见明显变化(P0.05),而H2O2 treated+RIPC-EXO组H9c2细胞的存活率明显上升(P0.05),而且WB检测到Bim及cleaved-caspase-3等凋亡蛋白的表达水平明显下调(P0.05),流式细胞仪检测结果显示细胞的凋亡率明显降低(P0.05),mi R-24的表达水平明显上升(P0.05)。然而相比H2O2 treated+RIPC-EXO组,H2O2treated+RIPC-EXO+mi R-24 inhibitor组细胞的细胞存活率又明显下降(P0.05),WB检测到Bim及cleaved-caspase-3等凋亡蛋白的表达水平明显上升(P0.05),流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示细胞的凋亡率明显增加(P0.05),mi R-24的表达水平明显下降(P0.05)。结论:1)H9c2细胞经过氧化应激处理后凋亡发生率明显增加,mi R-24的表达水平明显下调。2)远端缺血预适应诱导的外泌体能够减轻氧化应激处理后H9c2细胞的凋亡,其保护机制与外泌体传递mi R-24至细胞中下调促凋亡蛋白Bim的表达有关。第三部分:远端肢体缺血预适应诱导外泌体递送mi R-24减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤目的:本研究拟建立大鼠缺血再灌注损伤模型,从在体实验探讨远端缺血预适应诱导的外泌体对大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护效应。方法:1)通过可逆性结扎前降支45min,然后给予再灌注24h方法建立大鼠心脏缺血再灌注损伤模型,并用心电图验证模型是否建立成功,并分别在造模前及造模后24h后给予大鼠行心脏超声检查。2)观察RIPC处理后是否能够改善心脏缺血再灌注损伤,将大鼠分为以下四组:sham组,RIPC组,I/R组及RIPC+I/R组,然后通过心脏超声检测各组大鼠的心脏功能情况,处死各组大鼠后,将心脏取出行TTC染色。3)将远端缺血预处理诱导前后的外泌体通过心肌注射的方式至心肌缺血再灌注损伤周围,并根据注射的内容物不同分为以下六组:Control组、I/R+PBS组、I/R+EXO组、I/R+RIPC-EXO组、I/R+RIPC-EXO+mi R-24 antagomir组及I/R+RIPC-EXO+mi R-24 antagomir-NC组。再灌注24h后,用心脏超声检查各组大鼠的心功能情况,然后用深度麻醉的方式快速处死大鼠,并取心脏行TTC染色及心肌细胞TUNEL检测心脏细胞凋亡的水平,运用RT-PCR检测心脏mi R-24的表达情况。4)观察远端缺血预适应诱导的外泌体释放是否和大鼠双下肢HIF-1a蛋白表达水平升高有关,将大鼠分为以下四组:sham组,Cd组(HIF-1a抑制剂注射组),RIPC组,Cd+RIPC组。然后分别观察各组大鼠双下肢的HIF-1a表达水平及各组大鼠血浆外泌体的浓度水平。结果:1)大鼠的缺血再灌注损伤模型建立后,心脏超声提示心脏射血分数明显下降(P0.05),TTC染色结果提示心脏的缺血面积明显增加(P0.05)。2)RIPC组大鼠相比sham组大鼠,心脏功能及TTC染色结果没有统计学差异(P0.05),而RIPC+I/R组相比I/R组,大鼠的心脏功能明显改善(P0.05),心脏TTC染色结果显示心脏的梗死面积明显降低(P0.05)。3)与I/R+PBS组相比,I/R+EXO组的大鼠的心脏射血分数没有明显变化(P0.05),TTC染色结果显示心脏梗死面积没有明显下降(P0.05),TUNEL染色结果提示心脏细胞的凋亡率没有明显变化,而I/R+RIPC-EXO组的大鼠心脏射血分数明显提高,TTC染色结果显示心脏梗死面积明显下降(P0.05),TUNEL染色提示心脏细胞的凋亡率明显降低(P0.05),然而相比I/R+RIPC-EXO组,I/R+RIPC-EXO+mi R-24 antagomir组大鼠心脏射血分数又明显下降(P0.05),TTC染色结果显示心脏梗死面积明显升高(P0.05),TUNEL染色提示心脏细胞的凋亡率明显增加(P0.05)。4)大鼠经过远端缺血预适应后大鼠下肢的HIF-1a蛋白的表达水平明显升高(P0.05),与RIPC组相比,Cd+RIPC组大鼠血浆外泌体的浓度明显降低(P0.05)。结论:1)远端缺血预处理能够减轻大鼠心脏缺血再灌注引起的心脏损伤。2)远端缺血预适应诱导的外泌体能够传递mi R-24至缺血再灌注损伤的心肌细胞从而下调促凋亡蛋白Bim的表达减轻心脏缺血再灌注损伤。远端缺血预处理后大鼠下肢的HIF-1a的表达水平升高能够促进血浆中外泌体的释放。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R541
【图文】：

心肌保护作用,缺血再灌注损伤,缺血预适应,远端

远端缺血预适应诱导的外泌体携带miR-24对缺血再灌注损伤心肌保护作用

激光多普勒血流仪,血流量,止血带

第 2 章远端缺血预适应模型的建立及外泌体的提取与鉴定2.4 结果2.4.1 大鼠远端缺血预适应模型成功建立我们使用激光多普勒血流仪检测大鼠在使用止血带结扎双下肢之前及结扎之后的血流情况，结果发现在使用止血带结扎双下肢后，双下肢的血流相比结扎前明显减少，见图 2。经过定量统计分析表明使用止血带结扎前后双下肢的血流相比具有统计学差异，P<0.05，见图 3。

血流量,定量分析,止血带,微泡

图 3 定量分析 RIPC 前后血流量。定量分析结果显示大鼠双下肢使用止血带结扎后血流显着降低，差异具有统计学意义（结扎后 vs 结扎前，#P<0.05，n=3）。2.4.2 RIPC 前后血浆中微泡数量的变化

【参考文献】