组织蛋白酶S抑制剂影响小鼠缺血诱导的血管再生的机制研究
发布时间：2020-07-22 23:17
【摘要】：目的:组织蛋白酶S(CatS)通过修饰/分解各种生物活性物质调控内皮细胞(ECs)的生物活性。目前较多研究集中于CatS在动脉粥样硬化性心血管疾病中的表达及其作用,而在缺血性血管生成中表达及作用鲜有报道。最近,过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)在心血管系统和炎症-免疫细胞中的表达及其作用越来越受到重视,而关于织蛋白酶S抑制剂(CatS-I)影响小鼠缺血诱导的血管再生的信号通路研究甚少,本研究通过建立小鼠下肢缺血模型,探讨CatS-I影响小鼠缺血诱导的血管再生机制。方法:将8周龄、体重21～25g的野生型小鼠(C57/BL6,由日本名古屋大学动物实验室提供)按照随机数字表法分为两组:对照组和CatS-I组,每组各20只。对照组采用基础饲料饲养基础上再腹腔注射5%羧甲基纤维素钠盐(CMC),每天1次,共17天;CatS-I组在基础饲料饲养基础上再腹腔注射CatS-I[1mg/(kg·d)],每天1次,共17天。3天后,对两组小鼠腹腔注射戊巴比妥(60mg/kg)进行麻醉,切开小鼠左侧下腹部皮肤后,分离股神经结扎股动脉根部,剥离股动脉三个主要分支并结扎,然后切除股动脉主干及其分支,建立下肢缺血模型。采用激光多普勒血流成像仪分别测定术前、术后即刻、术后第4天、7天、14天血流,计算缺血肢与非缺血肢血流面积比;术后第4天取骨骼肌组织利用免疫印迹法检测与血管再生有关分子的蛋白表达水平,如过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)和血管内皮生长因子(VEGF)等蛋白水平;术后第14天,取骨骼肌组织作冰冻切片,采用CD31单克隆抗体免疫组化染色法标记血管内皮细胞以测定毛细血管数量和密度。计量数据以均数±标准差表示,组间比较采用Tukey post hoc test进行比较。计数资料的比较采用χ2检验。P0.05为差异有统计学意义。结果:(1)CatS-I明显抑制下肢血流的恢复。缺血与非缺血下肢血流比值统计结果显示:CatS-I组小鼠缺血下肢血流恢复明显慢于对照组(P0.05)。(2)CatS-I组明显抑制毛细血管的形成。术后第14天非缺血骨骼肌中,与对照组比较,CatS-I组毛细血管形成略减少,但差异无统计学意义(P0.05);但在缺血骨骼肌中,CatS-I组小鼠的毛细血管密度明显低于对照组(P0.01)。(3)免疫印迹法检测结果表明,CatS-I组小鼠中,PPAR-γ、p-Akt、p-eNOS和VEGF等蛋白表达水平与对照组比较明显减少(P0.05)。结论:CatS调控缺血性血管再生可能与PPAR-γ激活及Akt/eNOS信号通路有关,CatS有望成为治疗缺血性心血管疾病的新的分子靶点。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
【图文】：
后即刻两组小鼠缺血下肢血流无统计学差异；术后第４天ＣａｔＳ－Ｉ组小鼠缺血下肢血逡逑流恢复明显慢于对照组，差异具有统计学意义（户＜0．0１）；术后第７天、１４天ＣａｔＳ－Ｉ逡逑组缺血下肢血流恢复明显慢于对照组，差异具有统计学意义（ＰＯ．Ｏ〗）（图１）。逡逑对照组逡逑一对照诅逡逑＾邋＼邋＇逦１２邋逦逡逑术}卞危澹铃危危у义蟢x逦ｆｌ逦ｗ逦0邋术省邋水后w\由１铒４夭逦铒７夭邋铒１４夭逡逑图１两组缺血侧与非缺血侧下肢激光多普勒成像和血流灌注比值统计图逡逑注：激光多普勒血流中，红色代表高灌注，蓝色代表低灌注。与对照组比较＂ＰＯ．Ｏ】邋＞＜０．０５，逡逑ｎ＝８逡逑３．２利用ＣＤ３１免疫组化染色观察两组骨骼肌毛细血管的形成逡逑术后第１４天，取两组小鼠缺血与非缺血骨骼肌制作冰冻切片，利用ＣＤ３１免逡逑疫组化染色法观察毛细血管的形成。ＣＤ３１免疫组化染色图谱观察到：在非缺血骨逡逑骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ组毛细血管形成与对照组比较减少；在缺血骨骼肌中ＣａｔＳ－Ｉ组毛逡逑细血管形成与对照组比较明显减少。毛细血管密度统计图观察到：在非缺血骨骼逡逑９逡逑
图２术后第１４天两组小鼠缺血与非缺血骨骼肌中毛细血管密度比较卜４００）逡逑注：２Ａ：邋ＣＤ３１免疫组化染色图谱；２Ｂ：毛细血管密度统计图。ＮＳ：差异无意义。与对照组比较，＜0．0〗，ｎ＝６逡逑３．３免疫印迹法检测两组与血管再生有关分子的蛋白水平表术后第４天利用免疫蛋白印迹法检测两组与血管再生有关的分子蛋白平。免疫印迹图观察到：非缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ组ＰＰＡＲ－丫、ｐ－Ａｋｔ、ｐ－ｅＮＯＶＥＧＦ蛋白表达水平与对照组比较无明显差异。在缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ中ＰＰＡＲ－丫、ｐ－ｅＮＯＳ、ｐ－Ａｋｔ和ＶＥＧＦ表达明显低于对照组。半定量分析蛋白水平统计图结果表明：非缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ组ＰＰＡＲ－Ｙ、ｐ－Ａｋｔ、ｐ－ｅＮＯＳ和Ｖ蛋白水平与对照组比较差异无统计学意义。在缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ组ＰＰＡｐ－ｅＮＯＳ和ＶＥＧＦ表达明显低于对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．００１）邋；邋Ｃ组ｐ－Ａｋｔ表达明显低于对照组，差异有统计学意义（ＰＯ．ＯＳ）（图３）。逡逑１．６逡逑■邋ＰＰＡＲｙ逡逑＾ａｎｉ§ｔ８ｍ．邋sρ赭缹╁义
本文编号：2766505
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
【图文】：
后即刻两组小鼠缺血下肢血流无统计学差异；术后第４天ＣａｔＳ－Ｉ组小鼠缺血下肢血逡逑流恢复明显慢于对照组，差异具有统计学意义（户＜0．0１）；术后第７天、１４天ＣａｔＳ－Ｉ逡逑组缺血下肢血流恢复明显慢于对照组，差异具有统计学意义（ＰＯ．Ｏ〗）（图１）。逡逑对照组逡逑一对照诅逡逑＾邋＼邋＇逦１２邋逦逡逑术}卞危澹铃危危у义蟢x逦ｆｌ逦ｗ逦0邋术省邋水后w\由１铒４夭逦铒７夭邋铒１４夭逡逑图１两组缺血侧与非缺血侧下肢激光多普勒成像和血流灌注比值统计图逡逑注：激光多普勒血流中，红色代表高灌注，蓝色代表低灌注。与对照组比较＂ＰＯ．Ｏ】邋＞＜０．０５，逡逑ｎ＝８逡逑３．２利用ＣＤ３１免疫组化染色观察两组骨骼肌毛细血管的形成逡逑术后第１４天，取两组小鼠缺血与非缺血骨骼肌制作冰冻切片，利用ＣＤ３１免逡逑疫组化染色法观察毛细血管的形成。ＣＤ３１免疫组化染色图谱观察到：在非缺血骨逡逑骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ组毛细血管形成与对照组比较减少；在缺血骨骼肌中ＣａｔＳ－Ｉ组毛逡逑细血管形成与对照组比较明显减少。毛细血管密度统计图观察到：在非缺血骨骼逡逑９逡逑
图２术后第１４天两组小鼠缺血与非缺血骨骼肌中毛细血管密度比较卜４００）逡逑注：２Ａ：邋ＣＤ３１免疫组化染色图谱；２Ｂ：毛细血管密度统计图。ＮＳ：差异无意义。与对照组比较，＜0．0〗，ｎ＝６逡逑３．３免疫印迹法检测两组与血管再生有关分子的蛋白水平表术后第４天利用免疫蛋白印迹法检测两组与血管再生有关的分子蛋白平。免疫印迹图观察到：非缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ组ＰＰＡＲ－丫、ｐ－Ａｋｔ、ｐ－ｅＮＯＶＥＧＦ蛋白表达水平与对照组比较无明显差异。在缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ中ＰＰＡＲ－丫、ｐ－ｅＮＯＳ、ｐ－Ａｋｔ和ＶＥＧＦ表达明显低于对照组。半定量分析蛋白水平统计图结果表明：非缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ组ＰＰＡＲ－Ｙ、ｐ－Ａｋｔ、ｐ－ｅＮＯＳ和Ｖ蛋白水平与对照组比较差异无统计学意义。在缺血骨骼肌中，ＣａｔＳ－Ｉ组ＰＰＡｐ－ｅＮＯＳ和ＶＥＧＦ表达明显低于对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．００１）邋；邋Ｃ组ｐ－Ａｋｔ表达明显低于对照组，差异有统计学意义（ＰＯ．ＯＳ）（图３）。逡逑１．６逡逑■邋ＰＰＡＲｙ逡逑＾ａｎｉ§ｔ８ｍ．邋sρ赭缹╁义
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