网钙结合蛋白-2（Rcn2）对动脉损伤后内膜增生的影响及机制研究

发布时间：2020-07-22 22:45

【摘要】：目的:动脉粥样硬化是冠心病,缺血性中风和外周动脉疾病的主要原因。动脉粥样硬化病变可能直接或间接造成动脉狭窄或闭塞,影响重要器官的血供,并引起相应的缺血症状。介入经皮血管成形术及支架置入术是治疗闭塞性动脉疾病的主要方法。随着介入器械的发展及技术的进步,介入腔内治疗闭塞性动脉疾病有了长远的进步,但术后再狭窄问题仍然没有彻底解决。内膜增生是术后再狭窄的主要病理过程,新生内膜病变主要来源于由中膜向内膜异常增殖和迁移的血管平滑肌细胞。最近的一些研究指出血管再狭窄可能受到饮食因素及遗传因素等的影响。前期研究中我们发现 C3H/HeJ(C3H)和 C57BL/6J 小鼠在载脂蛋白-E(Apolipoprotein E,Apoe)敲除后动脉硬化易感性差异显著。通过数量性状基因座(Quantitative trait loci,QTL)的方法发现网钙结合蛋白2(Reticulocalbin-2,Rcn2)可能是导致这一差异的关键基因。本研究将首先通过动物实验明确Rcn2在高脂饮食加剧动脉损伤后内膜增生过程中的作用,并进一步探讨敲除Rcn2能够抑制内膜增生。其次通过细胞实验明确沉默Rcn2能否抑制血管平滑肌细胞增殖迁移及由氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱发的炎症反应。最后在下肢动脉硬化闭塞症患者血浆中检测Rcn2表达水平,分析Rcn2能否成为预测支架后再狭窄的生物学标志物。研究方法:1、动物实验中选取8-12周龄、体重20-25g的C57BL/6Apoe-/-小鼠(C57)、C57BL/6Apoe-/-Rcn2-/-小鼠(Rcn2),建立颈动脉结扎损伤模型。一组小鼠维持普通饮食,另一组在颈动脉损伤前1周开始喂食高脂饮食并一直维持高脂饮食至实验结束。分别于术后1天,3天,及1,2和4周获得颈动脉标本。病理学检查比较损伤段颈动脉管腔面积,内膜面积,内膜与中膜面积比值等形态学指标。免疫组化染色鉴定内膜增生病变的细胞成分。ELISA检测动物血清促炎因子分泌水平及血脂。2、细胞实验利用原代培养C57小鼠主动脉平滑肌细胞,选择用不同浓度的ox-LDL(50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml)刺激血管平滑肌细胞后,检测Rcn2在mRNA水平和蛋白水平表达情况。利用siRNA转染血管平滑肌细胞,划痕试验检测血管平滑肌细胞的迁移能力。MTT检测血管平滑肌细胞的增殖能力。ELISA法检测细胞上清液中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)的水平。3、收集2012年1月至2014年12月258例连续的股胭动脉慢性完全闭塞(CTO)病变患者的临床随访资料。其中180例患者纳入本研究,检测了其中62例患者留存血浆中的Rcn2水平,并与15例健康对照比较分析。同时还分析了所有患者中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)与再狭窄等的相关性。结果:1、普通饮食组C57小鼠发生了轻度高脂血症,总胆固醇水平为308.5±60.3mg/dl,而高脂饮食组的总胆固醇水平为858.5±88.4mg/dl,为严重高脂血症(p0.001)。两组高密度脂蛋白(HDL)水平都很低,甘油三酯水平相当(159.3±37.1 mg/dl和149.5±19.2mg/dl,p0.05)。高脂饮食组在术后1周后出现内膜增生,普通饮食组在术后2周出现内膜增生。随着时间的增加,两组内膜病灶均增大。术后4周时,高脂饮食组颈动脉平均内膜增生面积大约为普通饮食组的4倍(分别为112,987±11,395μm2和 29,539±7,0011μm2;n = 5,P0.001)。组织学上,高脂饮食术后1周后和普通饮食术后2周的内膜病变主要由泡沫细胞组成。在高脂饮食术后2周,内膜增生是典型的纤维斑块,其含有被纤维帽覆盖的许多泡沫细胞。在4周时,两个饮食组的内膜病变发展到更晚期的阶段,包含新生血管和动脉管腔明显变窄。Rcn2在普通饮食组的内膜病变中低表达,而在高脂饮食组的内膜病变中高表达。Rcn2在高脂饮食组血浆中浓度明显高于普通饮食组(18.93±1.76ng/ml,33.03±15.0lng/ml,n=5,p=0.029)。Rcn2小鼠在高脂饮食情况下发生了轻度高脂血症,总胆固醇水平明显低于C57小鼠(264±56mg/dl和858.5±88.4mg/dl,n=5,p0.001),HDL胆固醇和甘油三酯在两组中均无差异。Rcn2敲除明显抑制高脂饮食条件下,C57小鼠颈动脉损伤后内膜增生。主要抑制血管平滑肌细胞由中层向内膜下迁移,抑制血管壁细胞MCP-1的表达。术后4周,在Rcn2小鼠血浆中MCP-1(202.3±39.6ng/ml,349.3±67.1ng/ml,n=5,p=0.009)及 VCAM-1(110.6±20.7ng/ml,240.3±50.lng/ml,n=5,p=0.002)浓度明显低于C57小鼠。2、选择用不同浓度的ox-LDL(50ug/ml,100ug/ml,150ug/ml,200ug/ml)刺激血管平滑肌细胞 4 小时,Rcn2 的 mRNA表达和蛋白水平在150ug/ml时表达最高。用siRcn2转染血管平滑肌细胞后用ox-LDL刺激24小时,MTT测试显示,沉默Rcn2可抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖(p0.05)。用平板划痕实验检测发现沉默Rcn2后,穿过划痕的血管平滑肌细胞数量显著减少(p0.05)。ELISA检测细胞上清液中MCP-1及VCAM-1浓度显示沉默Rcn2可抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞分泌MCP-1及VCAM-1(p0.05)。3、共180例接受支架植入的股胭动脉CTO患者纳入本研究。根据支架再狭窄(ISR)的发生情况和ISR发生的时间将患者分为3组:非ISR组、早期ISR组(1年内)及晚期ISR组。非ISR组和早期ISR组的基线NLR,糖尿病,高脂血症,平均病变长度,流出道数量存在显著差异。在早期ISR组,基线NLR明显高于晚期ISR组(P = 0.03),且两组在处理ISR过程中球囊预扩张使用率(P0.01),远端栓塞发生率(P0.01)存在差异。单变量分析显示,基线NLR≥3.62与早期ISR相关,基线NLR3.62和NLR≥3.62组的早期ISR率分别为16%和32.72%(P0.01)。多变量logistic分析提示,基线NLR≥3.62是股胭动脉CTO患者支架置入术后早期ISR的独立预测因子。共检测其中62例患者及15例健康对照的血浆Rcn2浓度。依据患者在随访1年时是否出现再狭窄分为未再狭窄组和再狭窄组。采用单因素方差分析组间差异,发现三组Rcn2浓度具有统计学差异(F=29.59,P0.001)。Rcn2浓度与NLR明显正相关,而且Rcn2浓度与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)及缺血程度均相关。受试者操作特征曲线分析(ROC)用Rcn2和ISR来定义Rcn2临界值。ROC曲线下面积为0.901,Rcn2水平为80.43 ng/ml作为临界值,预测再狭窄的敏感性和特异性分别为 79.92%和 83.722%(p0.001)。结论:1、高脂饮食明显加剧C57小鼠颈动脉损伤后内膜增生。增生的内膜病变主要包括血管平滑肌细胞、泡沫细胞以及新生血管等。Rcn2在高脂饮食诱导的C57小鼠动脉内膜病变中高表达。Rcn2敲除能够明显抑制高血脂诱导动脉损伤后的内膜增生。2、ox-LDL能够诱导血管平滑肌细胞Rcn2表达增加。沉默Rcn2能够有效抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖及迁移。沉默Rcn2能够有效抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞促炎因子分泌。3、基线NLR≥3.62是股胭动脉CTO患者支架置入术后早期ISR的独立预测因子。基线NLR与ISR再次介入的难易程度和远端栓塞发生有关。Rcn2在股胭动脉CTO患者中表达明显升高。Rcn2与NLR呈正相关,并与患者下肢缺血程度及LDL-c水平相关。Rcn2有望成为下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄的生物学标志物。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5
【图文】：

乆动脉,完全闭塞,患者,低密度脂蛋白胆固醇

P<0.01），见图3.2。图3.2股乆动脉完全闭塞患者及健康对照血浆Rcn2水平Rcn2水平与NLR明显正相关,而且Rcn2水平与低密度脂蛋白胆固醇及缺血程度相关，见图3.3,3.4,3.5。图3.3，Rcn2浓度与NLR相关性分析

ROC曲线,血脂,患者,低密度脂蛋白胆固醇

中国医科大学博士学位论文41图3.4 Rcn2水平与下肢动脉硬化患者血脂及缺血程度的关系血脂正常0 2 4 6050100150200R=0.57p<0.01LDL-c(mmol/L)Rcn2(ng/ml)图3.5 Rcn2水平与低密度脂蛋白胆固醇相关性分析受试者操作特征曲线分析用Rcn2和早期ISR来定义Rcn2临界值。ROC曲线下面积为0.901，Rcn2为80.43 ng/ml，敏感性和特异性分别为79.92％和83.72％（p<0.001），详见图3.6。

乆动脉,再狭窄,完全闭塞,曲线分析

中国医科大学博士学位论文42图3.6 ROC曲线分析Rcn2预测下肢股乆动脉慢性完全闭塞患者支架再狭窄的效能4讨论大量研究显示炎症在ISR过程中起关键作用[45; 50; 131; 132]。炎症标志物如CRP被广泛使用[74-76; 133; 134]。在炎症标志物中，NLR是一种简单，相对便宜并且容易获得的指标;已被认为是动脉粥样硬化性心血管疾病分层和预后的有效生物标志物[48-53]。本研究NLR与CRP呈正相关。我们研究的平均NLR高于大多数其他研究报道的[48-53]。这种差异可能是由于研究设计差异所致。本研究纳入的患者为股乆动脉CTO患者。股乆动脉CTO病变的患者动脉粥样硬化程度较重[117; 135; 136]，我们推测严重的动脉粥样硬化可导致更高的NLR。我们研究中最重要的发现是，基线NLR≥3.62 与早期 ISR 风险呈独立正相关。在支架周围发生血小板和纤维蛋白沉积后，初始急性炎症伴随新生血管形成，平滑肌细胞迁移，增殖以及在几周内，慢性炎性细胞将代替急性炎性细胞形成肉芽组织[45; 70; 108; 132; 137]。在我们的研究中，晚期ISR的基线NLR低于非ISR的基线NLR

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