【摘要】：背景和目的:血管钙化(Vascular calcification,VC)是一个与骨发育相似的主动的、高度可调的复杂病理生理过程,是冠状动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管病变、血管损伤和慢性肾病等疾病中普遍存在的病理表现,同时也是心血管疾病发病率和死亡率增加的重要危险因素之一。因此,积极开展改善VC的相关研究具有重大科学意义和社会价值。Klotho(KL)基因于1997年被发现,作为一种抗衰老基因被广泛研究。Klotho基因敲除鼠表现出一系列与人类早衰综合征患者相似的表型,其中就包括VC。体内实验证实,使用基因整合技术或外源性补充重组蛋白的方式恢复Klotho敲基因鼠中Klotho的表达可显著改善VC。而体外研究也发现,Klotho重组蛋白可显著减轻高磷诱导的小鼠主动脉平滑肌(Mouse aorta vascular smooth muscle,MOVAS)细胞的成骨样分化(血管钙化的重要起始环节)。Klotho的抗钙化的作用机制可归结于两方面。首先体内KL的正常表达可以维持细胞外液的钙磷平衡,其次Klotho还可以直接抑制细胞中的insulin/IGF-1信号通路和Wnt信号通路,而这些因素都是VC的重要致病因素。但是否还有其它机制参与,仍有待探究。缝隙连接(Gap junction,GJ)是细胞间直接通讯的重要组成部分。其由缝隙连接蛋白(Conexin,Cx)所构成,作用是介导相邻细胞间能量和物质交换。在Cx家族中,Cx43是血管中表达最多的缝隙连接蛋白,且有报道指出,GJ介导的细胞间通讯对血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscles cells,VSMCs)的成骨样分化有直接影响。所以,Cx43可通过介导VSMCs的成骨样分化参与VC的发生。自噬是一种受刺激时,细胞内蛋白质和细胞器被降解的高度保守的病理生理过程,与许多疾病的发生发展密切相关。有研究证实,自噬起钙化抑制作用,且自噬可以降解Cx43。但在血管钙化模型中,Klotho与自噬的关系仍未可知。因此,本研究拟从体内实验入手,探究Klotho敲基因鼠中自噬和钙化的改变,然后调控自噬,明确自噬的作用。然后在体外实验中,验证Klotho是否可以通过促进自噬抑制血管钙化以及进一步明确自噬的作用;最后,结合体内外实验,探究Klotho是否可以通过促进自噬介导的Cx43降解抑制血管钙化。方法:2.1 Klotho敲基因鼠基因型鉴定和VC检测将Klotho杂合型(HZ)鼠合笼并繁殖后得到幼鼠,对幼鼠进行基因型鉴定后得到Klotho野生型(WT)和KL纯合型(KO)鼠。5周龄雄鼠可用于实验。取出Klotho敲基因鼠的主动脉,分别通过von kossa染色法检测VC情况,邻甲酚酞络合酮(OCPC)法检测小鼠主动脉中的钙含量,免疫组化法检测小鼠血管中Runx2的表达,q PCR实验检测钙化相关分子Pit1、Pit2、Runx2和SM22 m RNA的表达,western blot法检测Runx2和α-SMA蛋白的表达。2.2自噬在Klotho基因缺失导致血管钙化中的作用2.2.1检测Klotho基因敲除后,自噬的改变取出Klotho敲基因鼠的主动脉,提取总蛋白,western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达。血管行冰冻切片后,免疫荧光法观察并统计组间小鼠血管中LC3点数和P62荧光的差异。2.2.2调控自噬后,观察血管钙化的变化分别给予WT、KO鼠腹腔内注射适量的雷帕霉素(RA)和氯喹(CQ),2周后处死小鼠,取出主动脉,western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、Runx2和α-SMA蛋白的表达,,OCPC法检测小鼠主动脉的钙含量。2.3小鼠主动脉平滑肌(MOVAS)细胞鉴定细胞免疫荧光实验观察Alexa-488标记的α-SMA在细胞中的表达。2.4 MOVAS细胞的钙化诱导及鉴定将MOVAS细胞消化接种到6孔板中,实验组使用钙化培养液(Calcificaiton medium,CM)处理8-12天,对照组用普通培养液处理,每2天换液1次;分别使用茜素红S染色观察钙沉积情况,OCPC法检测MOVAS细胞中的钙含量。2.5 Klotho重组蛋白对自噬及VC的作用2.5.1 Klotho重组蛋白对自噬的作用使用Klotho重组蛋白伴/不伴有氯喹(自噬抑制剂)处理MOVAS细胞,western blot实验检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表达,双荧光LC3腺病毒转染MOVAS细胞后通过检测组间红点和黄点的差异来反映自噬流的改变。2.5.2 Klotho重组蛋白对血管钙化的作用使用Klotho重组蛋白伴/不伴有氯喹(自噬抑制剂)处理MOVAS细胞,western blot实验检测Runx2和α-SMA蛋白的表达,茜素红S染色实验观察钙沉积情况,OCPC法检测MOVAS细胞中的钙含量。2.6 Klotho对Cx43的作用2.6.1 Klotho敲基因鼠中Cx43表达的变化Western blot实验检测Klotho敲基因小鼠主动脉Cx43蛋白的表达。2.6.2 Klotho敲基因鼠中Klotho调控自噬对Cx43的作用外源性腹腔内给予Klotho重组蛋白伴/不伴有氯喹,western blot实验检测Cx43蛋白的表达。2.7体外实验中,Klotho重组蛋白调控自噬对Cx43的作用体外实验中,在Klotho重组蛋白的基础上,使用Cx43的si RNA干扰Cx43的表达,western blot实验检测Runx2和α-SMA蛋白的表达,茜素红S染色实验观察钙沉积情况,OCPC法检测MOVAS细胞中的钙含量。结果:3.1 Klotho敲基因鼠表型及鉴定从形态学来看,KO鼠形态明显小于WT和HZ鼠,有驼背,皮肤光泽度不佳。提取鼠尾DNA,PCR实验后跑电泳并显影。WT鼠只有野生型等位基因(458bp),KO鼠只有突变型等位基因(920bp),HZ鼠有两种等位基因都有。3.2 Klotho敲基因鼠主动脉出现明显血管钙化Von kossa实验结果显示:与WT鼠相比,HZ鼠主动脉开始出现钙化区域,KO鼠主动脉能观察到更多、更明显的钙化区域。OCPC法检测主动脉钙含量,结果显示:HZ组和KO组血管钙含量均明显高于WT组(p0.05,n=6),同时KO组血管钙含量高于HZ组(p0.05,n=6)。免疫组化实验检测主动脉Runx2表达,结果显示:Klotho基因被敲除后,Runx2的相对表达量逐渐增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05;n=6)。q PCR实验检测主动脉钙化相关因子m RNA的表达,结果显示:Klotho基因敲除后Pit1、Pit2及Runx2 m RNA的相对表达量均增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6),而SM22 m RNA的相对表达量降低(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6)。Western blot实验检测主动脉钙化相关分子蛋白的表达,结果显示:Klotho基因敲除后Runx2蛋白的相对表达量增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6),但α-SMA蛋白的相对表达量降低(WT vs.KO;p0.05,n=6)。3.3 Klotho基因被敲除后自噬上调Western blot实验检测Klotho敲除后小鼠主动脉自噬的改变,结果显示:随着Klotho基因的敲除,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6),而P62蛋白的相对表达量降低(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6)。免疫荧光实验检测LC3和P62的表达,结果显示:当Klotho基因被敲除后,LC3puncta/cell相对数量增加(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6),而P62的相对荧光强度逐渐降低(WT vs.HZ vs.KO;p0.05,n=6)。3.4在Klotho敲基因鼠体内调控自噬,检测钙化的改变Western blot实验检测使用雷帕霉素促进自噬后钙化的改变,结果显示:使用雷帕霉素促进自噬,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6)而P62蛋白的相对表达量降低(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6),钙化相关转录因子Runx2蛋白的相对表达量降低(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6),而骨架蛋白α-SMA的相对表达量增加(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6)。Western blot实验检测使用氯喹抑制自噬后钙化的改变,结果显示:使用氯喹抑制自噬,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加(KO vs.KO+CQ;p0.05,n=6)同时P62蛋白的相对表达量也增加(KO vs.KO+CQ;p0.05,n=6),钙化相关转录因子Runx2蛋白的相对表达量增加(KO vs.KO+CQ;p0.05,n=6),而骨架蛋白α-SMA的相对表达量降低(KO vs.KO+CQ;p0.05,n=6)。通过OCPC法检测主动脉钙含量,结果显示:KO鼠腹腔注射雷帕霉素促进自噬后,主动脉钙含量下降(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6),而给予氯喹抑制自噬后,主动脉钙含量增加(KO vs.KO+RA;p0.05,n=6)。3.5体外实验中用Klotho重组蛋白处理细胞后,检测钙化及自噬首先通过细胞免疫荧光实验鉴定所得细胞为MOVAS细胞株,并通过茜素红S染色及钙含量测定实验证明细胞钙诱导成功。Western blot实验检测给予Klotho重组蛋白处理后自噬的改变,结果显示:钙化诱导后,LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量增加(WT vs.CM;p0.05,n=3),但P62蛋白的相对量降低(WT vs.CM;p0.05,n=3)。在钙化诱导的基础上,使用Klotho重组蛋白处理细胞,发现LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量继续增加(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3),而P62蛋白的相对量继续降低(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3)。在Klotho重组蛋白基础上再使用氯喹抑制自噬,则LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量进一步增加(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p0.05,n=3),而P62蛋白的相对量升高(CM+KL vs.WT+KL+CQ;p0.05,n=3)。使用双荧光LC3腺病毒转染实验检测自噬流,结果显示:钙化诱导以后,自噬体数量(Control vs.CM;p0.01,n=3)和自噬溶酶体数量均增多(Control vs.CM;p0.01,n=3),说明自噬上调。钙化诱导的基础上,使用Klotho重组蛋白处理细胞,与CM组相比自噬体数量继续增多(CM vs.CM+KL;p0.01,n=3),自噬溶酶体数量也继续增多(CM vs.CM+KL;p0.01,n=3),说明自噬继续上调。在钙化诱导的基础上,同时使用Klotho重组蛋白和自噬抑制剂氯喹时,自噬体数量进一步增多(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p0.01,n=3),而自噬溶酶体数量降低(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p0.01,n=3),说明自噬体和溶酶体的结合受阻,自噬被抑制。3.6体内试验中,Klotho可通过促进自噬抑制血管钙化Western blot实验检测Klotho调控自噬对血管钙化的影响,结果显示:钙化诱导后,Runx2蛋白的相对表达量增加(Control vs.CM;p0.05,n=3),而α-SMA蛋白的相对表达量降低(Control vs.in CM;p0.05,n=3)。使用Klotho重组蛋白处理细胞后,Runx2蛋白的相对表达量降低(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3),而α-SMA蛋白的相对表达量恢复(in CM vs.CM+KL;p0.05,n=3),钙化缓解。但在使用KL重组蛋白的基础上用氯喹抑制自噬,Runx2蛋白的相对表达量再次回升(CM+KL vs.in CM+KL+CQ;p0.05,n=3),α-SMA蛋白的相对表达量再次降低(CM+KL vs.in CM+KL+CQ;p0.05,n=3),说明钙化再次加重。茜素红S染色和钙含量测定实验检测Klotho调控自噬对血管钙化的影响,从形态学来看,KL组相比于CM组的钙沉积较少,而额外使用CQ抑制自噬,相比于KL组,KL+CQ组的钙沉积又增多了。钙含量检测实验结果显示:使用Klotho重组蛋白处理细胞后,MOVAS细胞内钙含量降低(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3),而用氯喹抑制自噬后,钙含量再次增加(CM+KL vs.CM+KL+CQ;p0.05,n=3)。3.7 Klotho调控自噬对Cx43的影响Western blot实验检测Klotho敲基因鼠主动脉Cx43的表达,结果显示:KO鼠主动脉Cx43蛋白的相对表达量高于WT鼠(p0.01,n=6),且KO鼠主动脉Cx43蛋白的相对表达量也高于HZ鼠(p0.01,n=6);Western blot实验检测Klotho重组蛋白对Cx43蛋白表达的影响,结果显示:Klotho基因敲除后主动脉Cx43蛋白相对表达量增加(WT vs.in KO;p0.01,n=6),外源性给予Klotho重组蛋白后主动脉Cx43蛋白的相对表达量降低(KO vs.KO+KL;p0.05,n=6),在此基础上使用氯喹抑制自噬,主动脉Cx43蛋白的相对表达量反而上升(KO+KL vs.KO+KL+CQ;p0.05,n=6)。3.8 Klotho调控自噬介导的Cx43降解对血管钙化的影响Western blot实验检测Klotho调控自噬介导的Cx43降解对血管钙化的影响,结果显示:钙化诱导后,Runx2蛋白的相对表达量增加(Control vs.CM;p0.01,n=3)而α-SMA蛋白的相对表达量降低(Control vs.CM;p0.01,n=3);使用Klotho重组蛋白处理细胞后,Runx2蛋白的相对表达量降低(CM vs.CM+KL;p0.01,n=3),α-SMA蛋白的相对表达量有一定恢复(CM vs.CM+KL;p0.05,n=3);在Klotho重组蛋白的基础上,使用Cx43 si RNA干扰Cx43的表达,Runx2蛋白的相对表达量则又会降低(CM+KL vs.CM+KL+Si Cx43;p0.05,n=3),而α-SMA蛋白的相对表达量进一步恢复(CM+KL vs.CM+KL+Si Cx43;p0.05,n=3)。使用茜素红S染色及钙含量测定实验检测Klotho调控自噬介导的Cx43降解对血管钙化的影响,茜素红S染色结果显示:钙化诱导后,钙沉积增多,使用Klotho重组蛋白处理MOVAS细胞后,细胞内钙沉积减少,而在Klotho重组蛋白的基础上再用Cx43si RNA干扰Cx43的表达,则钙沉积进一步减少。钙含量检测实验中,钙化诱导以后,MOVAS细胞中钙含量明显增多(Cotrol vs.CM;p0.01,n=3),使用Klotho重组蛋白处理细胞,细胞内钙含量减少(CM vs.CM+KL;p0.01,n=3),而在Klotho重组蛋白的基础上再用Cx43 si RNA干扰Cx43的表达,则细胞内钙含量进一步减少(CM+KL vs.CM+KL+Si Cx43;p0.01,n=3)。结论:4.1 5周龄Klotho敲基因鼠主动脉出现明显血管钙化。4.2 Klotho敲基因鼠主动脉自噬上调,且这种上调是一种保护性改变。4.3 Klotho可通过促进自噬抑制血管钙化。4.4 Klotho可通过促进自噬介导的Cx43降解抑制血管钙化。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543
【图文】：
32图 1 Klotho 基因敲除鼠的表型比较Klotho 基因敲除鼠基因型鉴定生小鼠 3 周龄时，通过提取鼠尾 cDNA、PCR 扩增以及跑凝胶电泳等otho 基因敲除鼠的基因型。根据参考文献可知，WT 鼠只有野生型），HZ 小鼠既有野生型等位基因（458bp）也有突变型等位基因（9有突变型等位基因（920bp）。电泳结果显示（图 2），编号①、②、③分别是 HZ、KO、HZ、KO。
图 2 Klotho 敲除鼠基因型鉴定①、②、③、④指的是小鼠的编号，虚线提示其正上方为目标条带所在2.4.2 Klotho 基因敲除鼠主动脉钙化检测（1）Klotho 基因敲除鼠 Von kossa 钙化染色根据既往研究[15]，Von kossa 染色后，钙化部位会被染成深褐色或棕黑色。分别选择 WT、HZ、KO 鼠的主动脉切片进行 Von kossa 染色后，镜下观察并拍照。结果显示：与 WT 鼠相比（图 3A,B），HZ 鼠主动脉上能看到深染的钙化区域（图 3C,D）,而 KO 鼠主动脉能看到更加明显、数量更多深染的钙化区域（图 3E,F）。
图 2 Klotho 敲除鼠基因型鉴定①、②、③、④指的是小鼠的编号，虚线提示其正上方为目标条带所在2.4.2 Klotho 基因敲除鼠主动脉钙化检测（1）Klotho 基因敲除鼠 Von kossa 钙化染色根据既往研究[15]，Von kossa 染色后，钙化部位会被染成深褐色或棕黑色。分别 WT、HZ、KO 鼠的主动脉切片进行 Von kossa 染色后，镜下观察并拍照。结果显示 WT 鼠相比（图 3A,B），HZ 鼠主动脉上能看到深染的钙化区域（图 3C,D）,而 KO动脉能看到更加明显、数量更多深染的钙化区域（图 3E,F）。
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