AEBP1通过NF-κB通路促进腹主动脉瘤发生发展的研究

发布时间：2020-07-23 17:36

【摘要】：目的:腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm AAA)是以腹主动脉局部全层永久性扩张为特点,发病率与病死率均较高的一种血管疾病,常见于60岁以上老年人。随着全球老龄化加重,AAA的发病率在过去30年中提升了7倍,AAA早期并无一些特殊症状,随着瘤体的不断进展,一旦破裂,急诊死亡率高达90%,严重威胁中老年人群身体健康。AAA特征性的病理改变为各种炎性细胞的浸润、中层平滑肌细胞的凋亡、血管重塑、金属蛋白酶类增高以致动脉壁弹性纤维的降解以及胶原纤维的沉积等。其中,炎性细胞的浸润为主要特点,再此过程中,大量炎症细胞浸润到血管壁中,分泌蛋白水解酶及多种炎症因子并刺激平滑肌细胞分泌金属蛋白酶从而降解弹性纤维。我们蛋白质组学质谱结果显示,相比于正常的腹主动脉与主动脉粥样闭塞(aortic atherosclerotic occlusive disease AOD)患者,脂肪增强结合蛋白1(Adipocyte enhance binding protein 1 AEBP1)在AAA中表达明显增高。AEBP1是一种广泛表达的蛋白,其高表达在含细胞外基质较为丰富的组织中,像脂肪组织、大血管壁、皮肤等器官,AEBP1首先证实作为一种转录抑制因子抑制脂肪形成过程中的aP2基因活性,随后被证实为一种新型促炎因子,参与了巨噬细胞中胆固醇的外流以及炎症应答,AEBP1通过促进NF-κb p65的抑制因子IκBα的磷酸化后泛素化降解而促进NF-κB通路激活。传统的NF-κB通路中,在外界刺激下,IκBα磷酸化后降解,P-p65由细胞质中移位到细胞核中并与下游靶基因结合,参与炎症应答及金属蛋白酶的分泌。NF-κB通路可以促进AAA炎性细胞的浸润及MMPs的转录,多个动物实验表明,抑制NF-κB的活性可以抑制AAA的发展。目前,针对无症状的小的AAA治疗尚缺乏有效的方法,基因治疗应为主要方法之一,AEBP1与AAA的关系尚未明确报道。因此,本研究通过AAA临床标本、AAA动物实验造模以及体外细胞实验明确AEBP1与AAA的确切关系及其分子机制,旨在为AAA的发病机制提供新的实验依据,进而为AAA的基因治疗提供新的治疗思路和治疗靶点。方法:1.严格按照入选及排除标准,选用我院AAA患者,AOD患者以及正常对照(Healthy control HC)人群血清及临床标本,首先对三组临床标本进行蛋白质组学质谱技术检测差异表达的蛋白,随后进行ELISA、Real time PCR、Western Blot免疫印迹、免疫组化以及免疫荧光法检测AEBP1的表达情况以及NF-κB通路的激活状况。2.采用猪胰蛋白酶灌注的方法造AAA模型,并使用腺病毒外膜下注射方式沉默AEBP1基因表达,将55只SD大鼠随机分成假手术组(sham)、单纯造模组(control)、造模+无干扰序列腺病毒注射组(control+AV)、造模+AEBP1干扰腺病毒注射组(control+shAEBP1)。检测造模后动脉直径、HE、EVG及Masson染色从宏观到微观明确造模成功,Western Blot免疫印迹以及免疫荧光法检测AEBP1的表达情况、NF-κB通路的激活状况以及与动脉瘤相关的炎症因子TNFα、MCP-1、IL-6和IL-1β和金属蛋白酶MMP-2和MMP-9表达情况。3.对人AAA标本采用免疫双荧光共定位实验明确AEBP1在AAA中表达位置,依据结果采用人源血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell VSMC),慢病毒转染介导AEBP1基因沉默以及过表达,并使用NF-κB通路抑制剂BAY11-7082抑制NF-κB通路活性,将细胞分为空白组(Blank)、阴性对照组(NC)、AEBP1沉默组(Sh)、AEBP1过表达组(Over)以及各组添加NF-κB抑制剂组:Blank+BAY组、NC+BAY组、Sh+BAY组、Over+BAY组。Real time PCR及Western Blot免疫印迹法检测干扰效率,ELISA检测各组细胞培养上清液中炎症因子TNFα、IL-10、IL-6和IL-1β的表达,Western Blot免疫印迹法检测AEBP1的表达情况以及NF-κB通路的激活状况以及与动脉瘤相关的炎症因子TNFα、MCP-1、IL-10和IL-1β和金属蛋白酶MMP-2和MMP-9表达情况,免疫共沉定实验明确AEBP1与IκBα在VSMC中结合状况。结果:1.蛋白质组学质谱技术检测差异表达蛋白发现在AAA患者中AEBP1的表达明显高于对照组。临床标本Real time PCR、Western Blot免疫印迹以及免疫组化结果证实相比于AOD及HC组,AEBP1在AAA患者中mRNA及蛋白的表达明显异常增高,临床血清ELISA实验同样证实AEBP1在AAA患者血清中高表达。Western Blot及免疫荧光结果表明,在AAA患者中,NF-κB通路处于异常激活状态。2.动物实验:相比于sham组,control组及control+AV组瘤体直径明显增宽,炎性细胞浸润增多、弹性纤维破坏明显以及胶原纤维沉积增多,而采用腺病毒沉默AEBP1表达的control+shAEBP1组则可以明显减弱这些现象。Western Blot免疫印迹实验表明,control+shAEBP1组减少了AEBP1及p65的表达,同时相比于control组及control+AV组,炎症因子(TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β)及金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)表达也有所下调。免疫荧光及核蛋白Western Blot显示,进入细胞核的P-p65的表达在control+shAEBP1组也相应减少。3.免疫双荧光共定位实验表明AEBP1与中层血管平滑肌细胞标志SMA共表达。Real time PCR和Western Blot检测慢病毒成功介导了AEBP1基因的沉默和过表达。细胞培养上清液ELISA检测炎性因子表明,AEBP1表达沉默后,可以减少炎性因子(TNFα、MCP-1、IL-10、IL-1β)的释放,AEBP1过表达后,可以增加这些炎性因子的表达,而该作用皆可被NF-κB抑制剂BAY11-7082抑制。随后的Western Blot免疫印迹实验再次证实,沉默或过表达AEBP1的表达可以减少或提高相应的炎症因子(TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β)及金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的表达,核蛋白Western Blot免疫印迹同样表明,沉默AEBP1后减少P-p65的表达,上述结果皆可被BAY11-7082抑制,说明AEBP1促进炎症因子及MMPs的释放依赖于NF-κB通路的激活。免疫共沉淀实验证实,AEBP1与NF-κb通路抑制因子IκBα在VSMC中可以以蛋白-蛋白相结合而起作用。结论:本研究证实,AAA患者存在AEBP1的异常增高以及NF-κB通路的异常激活;在动物造模中沉默AEBP1的表达后,可以延缓AAA的发展过程以及减少NF-κB通路的异常激活;在VSMC中沉默或者过表达AEBP1,可以相应的减少或增多炎症因子及金属蛋白酶的表达,而添加NF-κB通路抑制剂BAY11-7082后可以抑制这些变化,表明AEBP1通过NF-κB通路而促进了AAA的发展过程。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.16
【图文】：

人群,患者,组标,免疫印迹

图 3.2 各组标本中 AEBP1、p65、IκBα的蛋白相对表达量 Western Blot 免疫印迹检测 AAA 患者，AOD 患者以及 HC 人群中 AEBP蛋白相对表达；图 B 半定量分析各组 AEBP1、NF-κB p65 及 IκBα的5，**p < 0.01。患者相比于对照组人群血清中 AEBP1 表达增高例 AAA 患者血清、12 例 AOD 患者血清及 38 例 HC 组人群血清表明，相比于 AOD 和 HC 组，AAA 患者血清中 AEBP1 表达明显8 vs AOD：0.27±0.32， p＜0.01；vs HC：0.01±0.03， p＜0.01），由于一些人群血清 AEBP1 的表达量低于试剂盒检测计结果（图 3.3）。以上研究提示，在血清中，AEBP1 在 AAA

实验检测,血清,石蜡切片,人群

图 3.3 ELISA 实验检测各组血清中 AEBP1 的表达量AAA患者，AOD患者以及HC人群血清中AEBP1表达，数据采用均相比于对照组人群石蜡切片中 AEBP1 表达增BP1 在石蜡切片中的表达状况，我们对各组标本进行显示，相比于 AOD 和 HC 组，在 AAA 组中，AEBP1 阳性阳性区域小（AAA：1.39±0.14 vs AOD：0.84±0.1302， p＜0.01；AOD vs HC，p＜0.01）（图 3.4）。结果1 在 AAA 患者中表达增高。

实验检测,免疫组化,表达水平,患者

图 3.3 ELISA 实验检测各组血清中 AEBP1 的表达量ELISA检测AAA患者，AOD患者以及HC人群血清中AEBP1表达，数据采用均数±标准差01。 AAA 患者相比于对照组人群石蜡切片中 AEBP1 表达增高为明确 AEBP1 在石蜡切片中的表达状况，我们对各组标本进行了免疫组化5），结果显示，相比于 AOD 和 HC 组，在 AAA 组中，AEBP1 阳性区域较广泛强，HC 组阳性区域小（AAA：1.39±0.14 vs AOD：0.84±0.13， p＜0.00.06±0.02， p＜0.01；AOD vs HC，p＜0.01）（图 3.4）。结果提示，在中，AEBP1 在 AAA 患者中表达增高。

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