Ox-LDL诱导后内皮细胞的N-糖蛋白及其糖链质谱分析

发布时间：2020-07-24 06:16

【摘要】：动脉粥样硬化是引起心血管疾病的重要原因,在其发生和发展中起着关键作用,可引起缺血性心脏病、缺血性中风和外周动脉疾病等。我国心血管疾病的发病率和死亡率不断上升,其死亡率目前排名第一。预防和治疗动脉粥样硬化对改善心血管疾病患者的预后至关重要。动脉粥样硬化的形成是一个复杂的过程,涉及内皮功能障碍、血管新生、自噬与凋亡、氧化应激、非编码RNA、基质降解、胆固醇、炎症和血栓形成等多种机制,其中炎症和免疫系统在其发生发展中发挥重要作用。目前关于动脉粥样硬化的发病机制和发展有不同的解释,大量研究表明ox-LDL诱导的内皮损伤或功能障碍是动脉粥样硬化中最早发生的事件,在多种疾病的发病机制中有重要作用。内皮细胞作为心血管疾病治疗的重要靶点,用ox-LDL刺激内皮细胞来模拟动脉粥样硬化病变是研究动脉粥样硬化的一个有效方法。糖基化在调节细胞功能和复杂生物过程中起着重要的作用。糖基化异常与自身免疫疾病、炎症和感染性疾病等多种疾病相关。研究表明糖基化可以通过影响粘附分子和趋化因子受体来影响白细胞的聚集,进而抑制动脉粥样化的形成,说明糖基化异常可能是引起动脉粥样硬化的原因之一。用组学方法对糖基化位点、糖蛋白及糖链进行表征,是研究糖基化在动脉粥样硬化的中发挥生物功能及开发新生物标志物的有效手段。本论文通过ox-LDL刺激内皮细胞来模拟动脉粥样硬化中出现的内皮损伤,对ox-LDL刺激的内皮细胞进行N-糖蛋白组学和N-糖组学研究。采用滤膜辅助的凝集素亲和富集法对N-糖肽进行富集,然后在H2180溶解的缓冲液中用PNGase F对糖链进行释放,用液质联用方法对糖蛋白、糖基化位点及糖链结构进行表征,并对差异糖基化位点占有率的糖蛋白进行生物信息学分析。本次实验共鉴定到1170个N-糖基化肽段,包含1248个N-糖基化位点,分布在768个N-糖蛋白上。其中N-糖基化位点占有率的变化大于1.3倍的共有120条糖肽,分布于92个糖蛋白上。GO功能富集结果表明这些差异糖蛋白主要分布在膜、细胞表面、胞外、液泡及溶酶体,在蛋白复合物结合、细胞外基质结合、受体结合和氧化还原酶活性等方面发挥重要作用。生物过程分析发现这些差异糖蛋白在细胞粘附、基质粘附、细胞迁移、细胞定位和应激反应等生物过程中发挥广泛生物学功能。蛋白-蛋白相互作用网络中以整合素家族形成的子网络为中心且密集程度最高。信号通路富集中最为显著的信号通路为P13K-Akt信号转导通路,其次溶酶体、黏着斑和细胞外基质受体相互作用等通路也有富集到。经过生物信息学分析发现整合素的糖基化修饰在ox-LDL刺激下明显变化,可能在致内皮损伤中发挥重要作用。通过PGC-LC-MS对内皮细胞N-糖链进行分析后共检测到100种不同分子量的N-糖链,其中有两种为ox-LDL刺激组特有,相对定量后发现52种N-糖链的变化在1.3倍以上,对所有糖链整体分析发现高唾液酸修饰的N-糖链含量明显增加。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.63;R54
【图文】：

Ｏｘ－ＬＤＬ通过多种不同的机制参与动脉粥样硬化斑块的形成和发展，包括逡逑诱导内皮细胞活化和功能障碍、巨噬细胞及泡沫细胞的形成、平滑肌细胞的迁移逡逑和增殖等动脉粥样硬化病变形成的过程如下图１－１：血管内皮细胞受刺激活逡逑化后，表达粘附分子并释放细胞因子和趋化因子；在趋化因子作用下，单核细胞逡逑通过血液循环聚集到损伤区域，通过与粘附分子的相互作用附着在内皮细胞上；逡逑然后单核细胞从内皮间隙中穿过后继而分化成为巨噬细胞；巨噬细胞可以通过清逡逑道夫受体对ｏｘ－ＬＤＬ进行吸收，引起脂质积累和泡沫细胞的形成；此外巨噬细胞逡逑活化后通过促进活性氧、促炎因子和参与基质降解的蛋白水解酶的释放来促进动逡逑脉粥样硬化斑块的不稳定；血管平滑肌细胞转化并迁移至内膜后在内膜中增殖并逡逑产生细胞外基质，导致内膜增厚和硬化，这些转化的血管平滑肌细胞也会吸收0ｘ－逡逑ＬＤＬ促进动脉粥样硬化的形成［５］。血浆中的ｏｘ－ＬＤＬ或其抗体己被发现与心血管逡逑１逡逑

种凝集素富集、ＰＮＧａｓｅ邋Ｆ糖链释放和ｉＴＲＱＡ标记，经２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ进行质谱逡逑分析，最后质谱数据经ＰＤ软件搜库对糖基化位点、糖肽及糖蛋白进行定性定量。逡逑如图２－２，为整合素Ｐ５部分肽段的二级质谱图，其中天冬酰胺处的分子量与实际逡逑分子量相差２．９８８邋Ｄａ，说明该位点发生Ｍ糖基化。逡逑２５０邋－Ｊ逦【Ｍ＋１Ｈ１，逡逑１１０９．６６２４８逡逑＾逦—邋Ｐａ＾Ｈ，邋Ｐｒｉｗｒｓｔｉｒ，邋Ｐａｘｉｉｒｓｏｒ－Ｈ－０，邋Ｐａ＾ｒｗｒ－Ｈ＾ＮＨｉ，邋Ｐｒｔ＇ｏｉｒｓｏｒ－ＮＨｉ，邋Ｐｒｅ－Ｈ逦包ＮｊＭ舟ｔ［ｋ逡逑—ｂ＾Ｈｊｏｉｂ－ＮＨ，逦ｂ，邋ｂｊ邋ｂ３邋ｂ４邋ｂ５邋ｂ，逡逑＾邋１５０邋－逡逑ｌ邋＇ｌＪｌ逡逑！逡逑｜邋１００－逦ＩＭ＋１Ｈ１＊＋Ｈ逡逑ｙｒ－ＮＨ，逦ｂ３＊逦ｂ，邋１１１0＊＾！＿＿逡逑１５８．０８１０９逦ｃｅ邋６２２．３５２４２逦９３５．５５２３１逡逑ｊ逦ｙ４＊逦ｂ２＊逦６０１．４０１５５邋ｙ逦＾逦１１０８．６５７４７逡逑５０邋＇逦ｙ

２．４．４蛋白相互作用网络逡逑用Ｓｔｒｉｎｇ做蛋白互作网络发现９５个差异蛋白中有５１个糖蛋白可与其它蛋白形逡逑成相互作用网络。经ＣｅｎｔｉＳｃａｐｅ和ＭＣＯＤＥ的中心度和ｋ核解析后作图２－７，图中节逡逑点大小是根据连接度（ｄｅｇｒｅｅ）显示的，节点颜色是根据ＡＭｆ基化位点占有率的逡逑上下调决定，红色表示上调，蓝色下调，黄色为上下调均有出现。其中ＣＬＵ、逡逑ＡＬＣＡＭ、ＬＡＭＰ１和１ＧＦ２Ｒ四种蛋白中上调和下调均出现。研究表明主动脉组织逡逑中的丛生蛋白（ＣＬＵ）随着动脉粥样硬化从脂质条纹向晚期病变的发展而增加。逡逑ＣＵＪ过度表达可以降低ＴＮＦ－ｏｃ／ＮＦｋＢ刺激产生的炎性趋化因子、细胞粘附分子和逡逑基质降解内肽酶，在动脉粥样硬化的预防和治疗中发挥保护作用ｔＳ７］。活化的白细逡逑胞粘附分子（ＡＬＣＡＭ／ＣＤＩ６６）可以介导细胞粘附并促进Ｔ细胞活化和增殖，与细逡逑胞迁移和白细胞侵入血管壁有关。ＡＬＣＡＭ为结肠癌和前列腺癌的标志物，具有逡逑２９逡逑

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本文编号：2768442