心肌缺血后处理中miR-499调控的HSP90对补体介导的心脏免疫炎症反应的影响及机制研究

发布时间：2020-07-24 10:12

【摘要】：补体系统激活是心肌缺血-再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)的重要特征。补体系统激活后除通过攻膜复合体直接造成心肌细胞损伤外,也可激活NF-κB、JNK、ERK1/2等信号转导通路,诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症细胞因子表达,诱发免疫炎症反应并引起心肌细胞凋亡、坏死。我们的前期研究发现,缺血后处理(ischemic postconditioning,IPC)以及缺氧后处理(hypoxia postconditioning,HPC)能够上调热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)表达,减轻缺血-再灌注(缺氧/复氧)引起的心肌细胞凋亡、坏死[1,2]。然而,尚不清楚后处理是否对补体系统具有调节作用。另外,有研究报道缺血后处理能够上调mi R-499表达,减轻缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡[3]。HSP90和mi R-499在缺血后处理中的保护作用是否存在某种联系,目前尚不清楚。我们假设,缺血后处理通过上调HSP90表达,抑制缺血-再灌注引起的补体活化,减轻补体介导的心脏免疫炎症反应和细胞凋亡,而mi R-499通过调节HSP90表达,参与缺血后处理中HSP90对心脏补体系统及免疫炎症反应的调节。为验证以上假设,我们建立了心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型和大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型,实施HPC和IPC,探讨后处理对补体活化、免疫炎症反应以及细胞凋亡的影响。研究发现,HPC和IPC可显著抑制缺血-再灌注(缺氧/复氧)引起的补体C3/C5a、NF-κB、IL-1β、TNF-α表达,降低心肌细胞凋亡率。以上结果提示后处理能够减轻补体介导的心脏免疫炎症反应和细胞凋亡。为探讨后处理抑制补体激活和免疫炎症反应的机制,我们在后处理基础上应用HSP90特异性抑制剂-格尔德霉素(Geldanamycin,GA),观察其对补体C3/C5a、NF-κB、IL-1β、TNF-α表达以及心肌细胞凋亡的影响。研究结果显示,后处理能够上调HSP90表达,并减少缺血-再灌注(缺氧/复氧)诱导的补体C3/C5a、NF-κB、IL-1β、TNF-α表达以及心肌细胞凋亡,而应用格尔德霉素之后这种效应被抵消。以上结果提示,HSP90介导了后处理对补体介导的心脏免疫炎症反应的抑制作用。最后,我们探讨了mi R-499在心肌缺血后处理中的作用及其与HSP90的关系。我们发现,缺血(缺氧)后处理能够显著上调mi R-499表达,并减少心肌细胞凋亡。为进一步探讨mi R-499在心肌缺血后处理中的作用机制,我们构建了mi R-499过表达和抑制表达病毒载体,对mi R-499过表达和抑制表达后的心肌细胞和大鼠心肌进行后处理。检测结果发现过表达mi R-499可显著上调后处理过程中心肌细胞和组织HSP90表达,同时显著增强后处理对补体C3/C5a、IL-1β、TNF-α、NF-κB表达以及心肌细胞凋亡的抑制,而抑制mi R-499表达后上述作用被显著减弱。以上研究结果提示,在缺血后处理中mi R-499通过上调HSP90表达减轻补体介导的心脏免疫炎症反应和细胞凋亡。第一部分缺血(缺氧)后处理对补体介导的心脏免疫炎症反应的影响及机制目的探讨缺血(缺氧)后处理对补体介导的心脏免疫炎症反应的影响及机制。方法研究分为细胞实验和动物实验两个部分。(1)细胞实验:建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,将细胞分为三组:对照组(正常培养9小时)、H/R组(缺氧3小时,再复氧6小时)、HPC组(缺氧3小时后行3个循环复氧/缺氧处理,每个循环5分钟,然后复氧6小时)。应用Hoechst 33258染色检测心肌细胞凋亡,Western blot检测心肌细胞补体C3/C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达。(2)动物实验:建立大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型。32只SD大鼠随机分为3组(每组8只):假手术(sham)组(前降支只穿线,不结扎)、I/R组(前降支结扎30分钟后再灌注2小时)、IPC组(前降支结扎30分钟后行3个循环再灌注/缺血处理,每个循环30秒,然后再灌注2小时)。采用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,Western blot检测大鼠心肌组织C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达。结果(1)与对照组比较,H/R组心肌细胞C3、C5a、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡显著增多;与H/R组比较,HPC组心肌细胞C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡显著减少。(2)与sham组比较,I/R组C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡显著增多;与I/R组比较,IPC组C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡显著减少。结论缺血(缺氧)后处理抑制缺血-再灌注(缺氧/复氧)诱导的补体活化,减轻补体介导的免疫炎症反应和细胞凋亡,其机制可能与其对NF-κB信号通路的调节有关。第二部分缺血(缺氧)后处理中HSP90对补体介导的心脏免疫炎症反应的影响及机制目的探讨缺血(缺氧)后处理中HSP90对补体介导的心脏免疫炎症反应的影响及机制。方法研究分细胞实验和动物实验两个部分。(1)细胞实验:建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,将细胞分为:对照组(正常培养9小时)、H/R组(缺氧3小时,复氧6小时)、HPC组(缺氧3小时后行复氧/缺氧各5分钟,共3个循环,再复氧6小时)、HPC+GA组(缺氧前15分钟加入HSP90抑制剂-格尔德霉素1μM,再行缺氧后处理)。采用Hoechst染色、流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况,Westernblot检测心肌细胞HSP90、C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达。(2)动物实验:建立大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型,32只SD大鼠随机分为4组(每组8只):sham组(前降支只穿线,不结扎)、I/R组(前降支结扎30分钟后再灌注2小时)、IPC组(前降支结扎30分钟后行再灌注/缺血各30秒,共3次后再灌注2小时)、IPC+GA组(大鼠腹腔注射格尔德霉素0.6mg/kg,操作同IPC组)。采用HE染色检测心肌结构损伤,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,ELISA、Western blot检测大鼠血清及心肌组织HSP90、C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达。结果(1)与H/R组比较,HPC组心肌细胞HSP90表达显著增多,C3、C5a、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡显著减少;与HPC组比较,HPC+GA组C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达及细胞凋亡显著增多;(2)与I/R组比较,IPC组血清及心肌组织HSP90表达显著增多,血清、心肌C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达显著减少,心肌组织损伤以及细胞凋亡显著减轻;与IPC组比较,IPC+GA组血清、心肌C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达显著增加,心肌组织损伤以及细胞凋亡显著加重。结论细胞和动物实验均表明,缺血(缺氧)后处理通过上调HSP90表达,抑制缺血-再灌注(缺氧/复氧)诱导的补体活化,减轻补体介导的免疫炎症反应、细胞凋亡、组织损伤。第三部分缺血(缺氧)后处理中mi R-499对心脏HSP90表达及补体介导的免疫炎症反应的影响目的探讨缺血(缺氧)后处理中mi R-499对心脏HSP90及补体介导的免疫炎症反应的影响及机制。方法(1)构建mi R-499过表达、mi R-499抑制表达、阴性对照慢病毒载体,转染H9C2心肌细胞,实施缺氧后处理。将细胞分为四组:缺氧后处理(HPC)组、阴性对照+缺氧后处理(NC+HPC)组、mi R-499过表达+缺氧后处理(mi R-499++HPC)组、mi R-499抑制表达+缺氧后处理(mi R-499-+HPC)组。采用荧光定量PCR检测心肌细胞mi R-499表达,Hoechst染色、流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Western blot检测心肌细胞HSP90、C3/C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达。(2)构建mi R-499过表达、抑制表达腺相关病毒载体,转染SD大鼠并实施缺血后处理。将大鼠分为4组(每组8只):缺血后处理(IPC)组、阴性对照+缺血后处理(NC+IPC)组、mi R-499过表达+缺血后处理(mi R-499++IPC)组、mi R-499抑制表达+缺血后处理(mi R-499-+IPC)组。采用荧光定量PCR检测心肌组织mi R-499表达,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,HE染色检测心肌结构损伤,ELISA、Western blot检测大鼠血清及心肌HSP90、C3/C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达。结果(1)与HPC组、NC+HPC组比较,mi R-499++HPC组HSP90表达显著增多,C3、C5a、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡率显著减少,而mi R-499-+HPC组HSP90表达显著减少,C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡率显著增加。(2)与IPC组、NC+IPC组比较,mi R-499++IPC组血清、心肌HSP90表达显著增加,血清、心肌C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡显著减少,心肌组织损伤减轻;而mi R-499-+HPC组血清、心肌HSP90表达显著减少,血清、心肌C3、C5a、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达以及细胞凋亡显著增加,心肌组织损伤加重。结论:缺血(缺氧)后处理过程中,mi R-499通过上调HSP90表达抑制补体活化,减轻补体介导的免疫炎症反应和心肌细胞、组织损伤。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
【图文】：

补体C3,后处理,肌细胞,补心

后处理中 miR-499 调控的 HSP90 对补心脏免疫炎症反应的影响及机制研究 2018 博表 1-2 各组细胞 C3、C5a 表达情况（目的/内参）组别 Control H/R HPCC3 27.8±1.6 93.4±2.4#64.2±2.1*C5a 32.9±1.7 92.3± 2.2#74.5±6.3*注：#与 Control 组比较 P<0.01，*与 H/R 组比较 P<0.01

炎症因子,肌细胞,后处理

3.4 缺氧后处理对心肌细胞炎症因子表达的影响如表 1-3、图 1-3 所示，H/R 组 TNF-α、IL-1β 表达量较 contro显著增多（P 均<0.01）；HPC 组 TNF-α、IL-1β 表达量较 H/R 组显减少（P 均<0.01）。

肌细胞,后处理,凋亡细胞,心肌细胞凋亡

氧后处理对心肌细胞炎症细胞因子表达的影响#与 Control 组比较 P<0.01 P<0.011-3 The effects of HPC on the expression of inflammatory cytokines氧后处理抑制缺氧/复氧心肌细胞凋亡ontrol组心肌细胞Hoechst 染色形态正常,呈圆形或椭圆少见凋亡细胞；H/R 组可见多个细胞核呈致密浓染，或呈染，颜色发白的凋亡细胞，细胞凋亡率较 control 组显7±0.44%vs.0.54±0.05%，P<0.01）；HPC 组细胞凋亡率（）较对 control 有所增加，但较 H/R 组显著减少（P<0.01。

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