Ⅰ JAK2突变在动脉粥样硬化与血栓形成中的作用和机制研究 Ⅱ ω3多不饱和脂肪酸代谢产物在早期非酒精性脂肪肝中的作用和

发布时间：2020-07-28 19:47

【摘要】：第一部分 JAK2突变在动脉粥样硬化与血栓形成中的作用和机制研究研究目的:Janus激酶2(Janus Kinase 2,JAK2)参与调控髓系细胞的生存、增殖、分化以及成熟细胞的功能。JAK2第617位密码子点突变(JAK2V617F)引起以克隆性造血细胞增生为主要表型的骨髓增生性肿瘤,除了能够明显增加造血系统肿瘤的发生率,是否影响心血管疾病的发生发展仍然未知。本研究的目的在于明确JAK2V617F突变对动脉粥样硬化与血栓形成的具体作用以及相关机制。方法结果:通过knock-in与LoxP-Cre系统构建造血系统(Mx1-Cre)特异性表达的JAK2V617F突变小鼠(Jak2~(VF)小鼠)。分离WT和Jak2~(VF)小鼠的骨髓移植入半致死量辐照的WT小鼠与Ldlr~(-/-)受体小鼠后,将实验动物分为4组,分别是WT受体小鼠组:WT/WT小鼠和Jak2~(VF)/WT小鼠以及Ldlr~(-/-)受体小鼠组:WT/Ldlr~(-/-)和Jak2~(VF)/Ldlr~(-/-)小鼠。骨髓移植经过6周恢复,给予WT受体小鼠正常饮食,Ldlr~(-/-)受体小鼠西方饮食(Western Diet,WD)喂养7周和12周,分别诱导早期与晚期动脉粥样硬化模型。通过流式分析饮食喂养后小鼠骨髓细胞组成与功能的改变,我们发现,7周WD喂养后,Jak2~(VF)/Ldlr~(-/-)小鼠相对于WT/Ldlr~(-/-)小鼠,造血干细胞的增殖明显增加。除此之外,循环中中性粒细胞、红细胞、血小板的数量均明显增加。其中中性粒细胞功能增加,表现为翻滚黏附功能增加。红细胞形态异常,表现为红细胞大小不均一性增加。血小板形态异常与功能增加,表现为平均血小板体积增加,血小板静息状态下活性增加,除此之外,血小板与单核细胞和巨噬细胞的黏附增加。通过HE染色评价7周与12周Ldlr~(-/-)背景小鼠主动脉粥样硬化斑块的面积与形态,我们发现,在早期的动脉粥样硬化模型中,Jak2~(VF)/Ldlr~(-/-)小鼠相对于WT/Ldlr~(-/-)小鼠,斑块面积明显增加,斑块中中性粒细胞的渗出增加显著,且渗出的中性粒细胞数目与斑块面积呈正相关性。而在晚期的动脉粥样硬化模型中,Jak2~(VF)/Ldlr~(-/-)小鼠相对于WT/Ldlr~(-/-)小鼠,动脉粥样硬化斑块面积稍有增加,但坏死核的绝对面积与相对于斑块的面积均显著增加。通过斑块内铁、红细胞、巨噬细胞染色发现,Jak2~(VF)/Ldlr~(-/-)小鼠斑块内巨噬细胞噬红细胞作用与斑块内铁沉积增加。进一步流式分析发现,Jak2~(VF)小鼠红细胞表面“don’t eat me”信号CD47的表达降低而脾巨噬细胞表面与吞噬相关的MerTK蛋白表达水平降低。免疫荧光染色发现,Jak2~(VF)/Ldlr~(-/-)小鼠斑块内巨噬细胞表面MerTK表达水平同样降低。通过LPS诱导腹腔来源巨噬细胞炎症反应,实时荧光定量PCR显示,Jak2~(VF)小鼠巨噬细胞炎症因子与趋化因子表达增加,与IFNγ信号通路相关的P38、JNK蛋白磷酸化增加,而P38、JNK抑制剂均能够逆转Jak2~(VF)小鼠巨噬细胞炎症因子表达增加的表型。结论:在我们的模型中,造血系统JAK2突变促进小鼠血栓的形成,引起小鼠早期动脉粥样硬化斑块面积增加与晚期斑块内坏死核面积增加。早期斑块面积的增加主要是由于JAK2突变引起的中性粒细胞的异常。晚期斑块坏死核的增加主要是由于:(1)斑块内铁沉积增加;(2)红细胞表面“don’t eat me”信号蛋白CD47表达降低引起巨噬细胞噬红细胞作用增加,巨噬细胞表面与吞噬相关受体MerTK表达降低,共同作用引起巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力降低,使Jak2~(VF)小鼠斑块内游离的凋亡细胞增加;(3)巨噬细胞炎症反应增加。综上所述,红细胞与巨噬细胞的异常共同作用引起Jak2~(VF)/Ldlr~(-/-)小鼠斑块坏死核面积增加。第二部分 ω3多不饱和脂肪酸代谢产物在早期非酒精性脂肪肝中的作用和机制研究研究目的:多种代谢疾病的发生发展常伴随肥胖的发生,包括糖尿病,动脉粥样硬化以及非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)。研究发现,短期高脂饮食足以诱发脂肪炎症和NAFLD,而高脂饮食引起的NAFLD等代谢性疾病的早期发病机制尚未完全阐明。饮食中的ω3多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid,PUFA)在非酒精性脂肪肝中具有保护作用。主要发挥作用的是二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid,EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)。本研究旨在探究ω3 PUFA及其代谢产物在NAFLD早期发生过程中的作用及机制,期望发现具有保护作用的代谢产物,为临床预防及治疗NAFLD提供新的靶点。方法结果:首先选取6-8周龄的野生型小鼠C57BL/6,分别给予正常饮食(Ctrl),高脂饮食(High Fat Diet,HFD),以及高脂饮食添加3%ω3 PUFA饮食(ω3 HFD),喂养4天后取材评价早期NAFLD的进展情况。HE染色发现,HFD与ω3 HFD组小鼠的肝脏形态无明显差异。油红O染色以及肝脏脂质抽提显示,ω3 PUFA的添加显著改善HFD喂养引起的肝脏脂质沉积。实时荧光定量PCR显示,ω3PUFA通过降低肝脏脂质生成相关基因的表达,增加β氧化相关基因的表达改善HFD诱导的肝脏脂肪变性。脂肪组织免疫组化显示,ω3 PUFA可显著逆转由短期高脂饮食引起的脂肪组织炎症细胞的浸润。进一步结合超高液相色谱串联质谱法检测血浆以及肝脏中PUFA及其代谢产物的浓度。结果发现,在HFD组中,EPA的代谢产物多种HEPEs和EEQs显著降低,而ω3 HFD组显著增加,提示HEPEs和EEQs可能在ω3 PUFA肝脂肪变性中发挥保护作用。在软脂酸诱导的小鼠原代肝细胞脂质沉积模型中,EPA和DHA的混合物以及HEPEs、EEQs均未改善软脂酸诱导的肝细胞脂质沉积。但ω3 PUFA的补充可以显著改善短期HFD引起的脂肪组织巨噬细胞浸润以及血浆中炎症因子水平。为进一步筛选HEPEs和EEQs中的有效成分,分别用单个代谢产物处理巨噬细胞,结果显示,17,18-EEQ、5-HEPE和9-HEPE降低了软脂酸诱导的炎症因子和趋化因子的表达以及JNK信号通路的激活。进一步在体研究17,18-EEQ、5-HEPE和9-HEPE的混合物对短期HFD所致肝脏脂质沉积的作用,在HFD喂养小鼠的同时腹腔注射17,18-EEQ、5-HEPE和9-HEPE的混合物,我们发现此混合物显著改善了肝脏脂质沉积和脂肪组织炎症。我们的实验证明,17,18-EEQ、5-HEPE和9-HEPE通过改善脂肪组织炎症介导了ω3 PUFA对短期HFD所致肝脏脂质沉积的保护作用。结论:ω3 PUFA通过改善小鼠脂肪组织炎症,降低血浆中炎症因子水平,继而减轻肝脏的脂质沉积。质谱分析发现,EPA的代谢产物HEPEs和EEQs是ω3 PUFA保护作用可能的有效成分。进一步实验证实,17,18-EEQ、5-HEPE和9-HEPE能够抑制软脂酸诱导的巨噬细胞炎症因子表达和JNK信号通路激活,从而改善短期HFD引起的脂肪组织炎症和肝脏脂质沉积。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54;R575.5
【图文】：

医科大学博士学位论文 结果 饮食诱导下 Jak2VF突变小鼠血细胞的组成变化与影响JAK2V617F 突变对于动脉粥样硬化与血栓形成发生发展的影响以及高西方饮食（Western Diet, WD）与 JAK2V617F 之间可能存在的相互作死量辐照 6-8 周 WT 和 Ldlr-/-背景小鼠，分别移植 WT 和 Jak2VF小鼠的，经过6 周恢复后，给予 WT/WT和Jak2VF/WT 小鼠正常饮食(Chow Diet,，WT/Ldlr-/-和 Jak2VF/Ldlr-/-小鼠 WD 饮食喂养 7 周和 12 周，诱导早期脉粥样硬化模型（图 2）。

图 4. 7 周 WD 饮食喂养后小鼠骨髓内造血干细胞与祖细胞组成。（A）小鼠骨髓中各系祖细胞在骨髓细胞中所占的数目百分比。数据显示为 Means ± SEM，Bonferroni 校正后的双向方差分析（Two-Way ANOVA With Bonferroni Post-Test）* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，n = 7。2.1.2 WD 喂养后血细胞数目及功能的改变（1） 单核细胞和中性粒细胞：Jak2VF/Ldlr-/-相对于 WT/Ldlr-/-小鼠，循环血中单核细胞数量有增加的趋势（图 5A）；Jak2VF小鼠（Jak2VF/WT，Jak2VF/Ldlr-/-）相对于 WT 小鼠（WT/WT，WT/Ldlr-/-）（图 5A），中性粒细胞的数目明显增加，WD 饮食进一步增加 Jak2VF小鼠中性粒细胞数目（图 5B）。

图 4. 7 周 WD 饮食喂养后小鼠骨髓内造血干细胞与祖细胞组成。（A）小鼠骨髓中各系祖细胞在骨髓细胞中所占的数目百分比。数据显示为 Means ± SEM，Bonferroni 校正后的双向方差分析（Two-Way ANOVA With Bonferroni Post-Test）* p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，n = 7。2.1.2 WD 喂养后血细胞数目及功能的改变（1） 单核细胞和中性粒细胞：Jak2VF/Ldlr-/-相对于 WT/Ldlr-/-小鼠，循环血中单核细胞数量有增加的趋势（图 5A）；Jak2VF小鼠（Jak2VF/WT，Jak2VF/Ldlr-/-）相对于 WT 小鼠（WT/WT，WT/Ldlr-/-）（图 5A），中性粒细胞的数目明显增加，WD 饮食进一步增加 Jak2VF小鼠中性粒细胞数目（图 5B）。

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本文编号：2773361