抑制Caspase-3对Beclin-1的剪切可提高心肌细胞缺血再灌注后的自噬、降低坏死和凋亡
发布时间：2020-07-29 11:39
【摘要】：目的:探究大鼠H9C2心肌细胞在缺氧复氧过程中Beclin-1是否被Caspase-3剪切,以及抑制Beclin-1的剪切对H9c2细胞缺氧复氧后自噬、凋亡和坏死的影响。方法:本研究用大鼠H9c2心肌细胞缺氧复氧作为模型,观察复氧过程中Beclin-1及其剪切体的蛋白表达;将H9c2心肌细胞用Caspase-3抑制剂(Ac-DEVD-CHO)预处理后(Caspase-3 Inhibition,Cp3I),再进行缺氧5小时后复氧2小时(hypoxia 5 hours reoxygenation 2 hours,H5R2)处理。比较Cp3I+H5R2组、H5R2组、Cp3I组和假手术组的Beclin-1及其剪切体的蛋白表达;同时根据氨基酸序列比对,将Beclin-1在147号易被Caspase-3剪切的天冬氨酸突变为谷氨酸,并分别将突变型Beclin-1(M-Beclin-1)和未突变型Beclin-1(W-Beclin-1)转染至H9c2细胞中,再比较缺氧5小时复氧2小时后两组Beclin-1及其剪切体的表达和分布;最后运用流式细胞仪来检测M-Beclin-1组和W-Beclin-1组在缺氧5小时后的复氧过程中,细胞自噬、凋亡和坏死水平的变化。结果:在大鼠H9c2心肌细胞缺氧5小时后复氧的过程中,Western Blot上出现了Beclin-1剪切体的印记;Cp3I+H5R2组中Beclin-1的剪切体数目少于H5R2组(p0.001);M-Beclin-1组在细胞缺氧5小时复氧2小时后,Beclin-1被剪切现象明显少于W-Beclin-1组(p0.05);在细胞中分别过表达未突变型和突变型的Beclin-1后,两组细胞随着复氧时间的推移,细胞自噬水平先增加后减少,但突变组的自噬程度高于同时期的未突变组。过表达未突变型的细胞随着复氧时间的推移,凋亡的细胞和坏死的细胞不断增多;过表达突变型的细胞随着复氧时间的推移,细胞的凋亡和坏死均维持在低水平。结论:本实验方法和条件下得出的结论如下:在大鼠H9c2心肌细胞缺氧复氧的过程中,存在着Beclin-1被Caspase-3剪切的现象,且抑制Beclin-1剪切,可以提高复氧后的细胞的自噬水平,降低细胞凋亡和坏死的水平,为临床上治疗缺血性心肌病提供新的思路。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：
图 2.3.2.1 实验分组Fig. 2.3.2.1 Experimental grouping缺氧 5h 复氧 0h（H5R0 组）：H9c2 细胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培养 5 小时后，取出细胞。缺氧 5h 复氧 1h（H5R1 组）：H9c2 细胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培
0.05)；随着复氧的时间继续延长，复氧 2 小时后 50kDa 处的剪切体的表达明显高于复1 小时后(p< 0.05)，复氧 3 小时后 50kDa 处的剪切体的表达明显高于复氧 2 小时后0.05)。2.3.2 在 H9c2 缺氧复氧过程中 Beclin-1 被剪切和 Caspase-3 的活性相关2.3.2.1 实验分组对照组（Control 组）：H9c2 细胞用完全培养基培养于 37℃、95%空气、5%CO2连续培养。缺氧复氧组（H/R 组）：H9c2 细胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培养小时后，再用复氧液置换缺氧液，将细胞在 37℃、95%空气、5%CO2中培养 2h。Caspase-3 抑制组（Cp3I 组）：将 Caspase-3 抑制剂处理后的 H9c2 细胞用完全培养基养于 37℃、95%空气、5%CO2中，连续培养。Caspase-3 抑制后缺氧复氧组（Cp3I+H/R 组）：将 Caspase-3 抑制剂处理后的 H细胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培养 5 小时后，再用复氧液置换缺氧液将细胞在 37℃、95%空气、5%CO2中培养 2h。
a)抑制 Caspase-3 后 Beclin-1 及其剪切体在复氧 2 小时的表达. *** p <0统计( x±SD)。(a) The expression of Beclin-1 and its fragments after reoxygenation for 2h afCaspase-3. ***p< 0.001. (b) Data statistics( x±SD).t结果显示，和对照组相比，H/R组Beclin-1剪切体的表达明显增R 组相比，H/R 组 Beclin-1 剪切体的表达也明显增多（p<0.001）结究内容包括： H9c2 心肌细胞缺氧复氧过程中，Beclin-1 被剪切；制作 H9c2 复氧的 time course，挑选了复氧过程中 Beclin-1 被剪复氧后第 2 小时。为后续实验提供了检测 Beclin-1 剪切程度的时间越长，Beclin-1 剪切体的表达越多； Caspase-3 可减少 Beclin-1 的剪切。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：
图 2.3.2.1 实验分组Fig. 2.3.2.1 Experimental grouping缺氧 5h 复氧 0h（H5R0 组）：H9c2 细胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培养 5 小时后，取出细胞。缺氧 5h 复氧 1h（H5R1 组）：H9c2 细胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培
0.05)；随着复氧的时间继续延长，复氧 2 小时后 50kDa 处的剪切体的表达明显高于复1 小时后(p< 0.05)，复氧 3 小时后 50kDa 处的剪切体的表达明显高于复氧 2 小时后0.05)。2.3.2 在 H9c2 缺氧复氧过程中 Beclin-1 被剪切和 Caspase-3 的活性相关2.3.2.1 实验分组对照组（Control 组）：H9c2 细胞用完全培养基培养于 37℃、95%空气、5%CO2连续培养。缺氧复氧组（H/R 组）：H9c2 细胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培养小时后，再用复氧液置换缺氧液，将细胞在 37℃、95%空气、5%CO2中培养 2h。Caspase-3 抑制组（Cp3I 组）：将 Caspase-3 抑制剂处理后的 H9c2 细胞用完全培养基养于 37℃、95%空气、5%CO2中，连续培养。Caspase-3 抑制后缺氧复氧组（Cp3I+H/R 组）：将 Caspase-3 抑制剂处理后的 H细胞用缺氧液先在 37℃、95%N2、5%CO2中培养 5 小时后，再用复氧液置换缺氧液将细胞在 37℃、95%空气、5%CO2中培养 2h。
a)抑制 Caspase-3 后 Beclin-1 及其剪切体在复氧 2 小时的表达. *** p <0统计( x±SD)。(a) The expression of Beclin-1 and its fragments after reoxygenation for 2h afCaspase-3. ***p< 0.001. (b) Data statistics( x±SD).t结果显示，和对照组相比，H/R组Beclin-1剪切体的表达明显增R 组相比，H/R 组 Beclin-1 剪切体的表达也明显增多（p<0.001）结究内容包括： H9c2 心肌细胞缺氧复氧过程中，Beclin-1 被剪切；制作 H9c2 复氧的 time course，挑选了复氧过程中 Beclin-1 被剪复氧后第 2 小时。为后续实验提供了检测 Beclin-1 剪切程度的时间越长，Beclin-1 剪切体的表达越多； Caspase-3 可减少 Beclin-1 的剪切。
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本文编号：2773912
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