血管扩张刺激磷蛋白在冠状动脉粥样硬化中的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-30 03:40

【摘要】：背景炎症状态和内皮功能紊乱是动脉粥样硬化的启动因素。冠心病患者的心外膜脂肪组织多为白色脂肪组织,包饶在冠状动脉周围,可通过分泌炎症脂肪因子影响内皮功能,在冠状动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用。血管扩张刺激磷蛋白(vasodilator stimulated phosphoprotein,VASP)是一种肌动蛋白结合蛋白,在与细胞骨架调节相关的各种细胞行为中发挥着重要作用。目的探讨VASP是否可以通过改变细胞骨架极性调节心外膜脂肪细胞棕色和白色表型之间的转换,及其对脂肪因子抵抗素促进内皮细胞增殖、迁移功能的影响。方法:第一部分(1)取南京总医院行瓣膜置换术的非冠心病患者的心外膜脂肪组织离体培养,并诱导分化为成熟棕色脂肪细胞,观察细胞形态及油红染色观察成脂情况。(2)用同一浓度的IL-6(100ng/ml)作用成熟脂肪细胞,通过RT-PCR方法检测棕色脂肪基因(UCP-1,PRDM16)与白色脂肪基因(resistin,RIP140)表达水平。(3)利用RNA干扰技术,在成熟棕色脂肪细胞分别转染阴性对照载体LV-control siRNA(LV-sicntr)和慢病毒表达载体LV-VASPsiRNA(LV-siVASP)后,RT-PCR法和蛋白免疫印迹法检测两组细胞VASP表达,并利用免疫荧光双重染色观察肌动蛋白细胞骨架结构。(4)成熟棕色脂肪细胞分别转染LV-control siRNA(LV-sicntr)和LV-VASPsiRNA(LV-siVASP)后,通过RT-PCR的方法检测LV-sicntr和 LV-siVASP两组UCP-1,PRDM16与resistin,RIP140表达变化。(5)RT-PCR的方法检测检测在LV-sicntr和LV-siVASP两组炎症因子IL-6,IL-8,MCP-1,TNF-α 的表达。(6)采用VASP基因敲除的脂肪细胞,实验组加入RhoA/ROCK抑制剂Y-27632抑制ROCK活性,RT-PCR的方法检测UCP-1,PRDM16与resistin,RIP140表达水平;并检测炎症因子IL-6,IL-8,MCP-1,TNF-α的表达。第二部分(1)不同浓度的抵抗素(Ong/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)体外作用于人冠状动脉内皮细胞系(HCAECs),MTT法检测抵抗素对细胞增殖的作用,Transwell小室实验检测细胞迁移能力的改变。(2)构建针对人VASP的慢病毒表达载体(LV-siVASP)和阴性对照载体(LV-sicntr),并将其感染HCAECs,RT-PCR检测VASPmRNA的表达,Western blot测定蛋白的表达。在相同抵抗素浓度(100ng/ml)下,检测LV-sicntr组、LV-sicntr+resistin组和LV-siVASP组+LV-siVASP+resistin组对内皮细胞增殖、迁移影响。(3)免疫荧光法分析LV-sicntr和LV-siVASP组细胞表面受体血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)表达情况。结果第一部分:(1)人心外膜原代前脂肪细胞大多数呈梭形改变,诱导分化12-20天后可见80%以上细胞内可见大小不等的多脂滴脂肪细胞。油红0染色后棕色脂肪细胞内脂滴被染成红色。(2)RT-PCR结果表明:在同一浓度的IL-6(100 ng/ml)下,棕色表型基因UCP-1,PRDM16表达量逐渐减少,白色表型基因resistin,RIP140表达量逐渐增加,差异有统计学意义(P0.05)。(3)转染慢病毒48h后,RNA表达抑制率为68.1%,VASP蛋白表达抑制率为59.3%,与LV-sicntr阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。成熟脂肪细胞转染VASP-shRNA质粒48h后,转染组与对照组相比,规律成束的长应力纤维减少,大多数为凌乱的短纤维。(4)RT-PCR结果表明:与LV-sicntr阴性对照组比较,LV-siVASP组UCP-1,PRDM16表达量逐渐减少,resistin,RIP140表达量逐渐增加,差异有统计学意义(P0.05)。而且,与LV-sicntr阴性对照组比较,LV-siVASP组炎症因子IL-6,IL-8,MCP-1,TNF-α的表达,差异有统计学意义(P0.05)。(6)在VASP敲除脂肪细胞,实验组加入RhoA/ROCK抑制剂Y-27632后,RT-PCR方法检测显示,与LV-siVASP组比较,实验组炎症因子IL-6,IL-8,MCP-1,TNF-α的表达明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。此外,与LV-siVASP组比较,实验组UCP-1,PRDM16表达增加,resistin,RIP140表达减少,差异有统计学意义(P0.05)。第二部分(1)与对照组相比,50-200ng/ml抵抗素作用48h或12h后,呈剂量依赖性的促进细胞增殖、迁移(P0.05);(2)与转染LV-sicntr阴性对照组相比,LV-siVASP组VASP表达在基因与蛋白水平均明显下降(P0.05);(3)与转染LV-sicntr+resistin组相比,LV-siVASP组+resistin细胞的增殖、迁移能力明显减弱(P0.05)(4)LV-s i cntr组和LV-s i VASP组血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)表达情况未见明显差异。结论第一部分(1)在成熟棕色脂肪细胞,沉默基因VASP后,促进脂肪细胞棕色到白色转化,且炎症因子的表达增加,表明炎症因子在敲除VASP后参与的脂肪细胞表型转换中发挥了重要作用。(2)在VASP敲除棕色脂肪细胞,抑制RhoA/ROCK活性,炎症因子的表达减少,抑制了棕色到白色脂肪细胞转化,表明敲除脂肪细胞VASP后的表型转换可能与RhoA/ROCK活性有关。第二部分(1)抵抗素呈浓度依赖性的促进冠状动脉内皮细胞增殖、迁移。(2)抵抗素可通过VASP信号分子促进内皮细胞增殖和迁移。(3)VASP对抵抗素功能的影响与VEGFR2表达无关。总论:VASP参与心外膜脂肪细胞棕色和白色之间的转换,可能RhoA/ROCK介导的炎症因子的表达有关,且VASP在抵抗素促进内皮细胞增殖、迁移功能中发挥重要作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R541.4
【图文】：

图１邋（Ａ）人心外膜前脂肪细胞的形态（Ｂ）人心外膜成熟脂肪细胞的形态逡逑（Ｃ）油红０染色后的脂肪细胞逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１逦（Ａ）邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋（Ｂ）邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｈｍａｔｕｒｅ邋ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋（Ｃ）邋Ｈｕｍａｎ邋ｍａｔｕｒｅ邋ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋Ｏｉｌ邋Ｒｅｄ邋Ｏ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑

膜脂肪细胞较对照组（ＬＶ－ｓｉｃｎｔｒ）的ＶＡＳＰ的基因和蛋白表达明显减少（图３）。逡逑Ｅｎａ／ＶＡＳＰ家族促进肌动蛋白纤维的形成，对照组为长且有规律的肌动蛋白纤逡逑维，沉默ＶＡＳＰ后可见短且零乱的肌动蛋白形成（图４邋Ａ）。在ＶＡＳＰ沉默成功后，逡逑我们继续研宄了ＶＡＳＰ对心外膜脂肪细胞表型的影响。ＲＴ－ＰＣＲ检查结果提示：逡逑ＬＶ－ｓ邋ｉＶＡＳＰ组成熟心外膜脂肪细胞内ＵＣＰ－ｌ，邋ＰＲＤＭ１６基因表达逐渐减少，逡逑ｒｅｓｉｓｔｉｎ，ＲＩＰ１４０基因表达逐渐增加，差异有统计学意义（图４Ｂ，邋Ｐ〈０．邋０５），逡逑表明沉默ＶＡＳＰ促进棕色脂肪细胞白色化。接着我们进一步检测了在白介素－６逡逑（１００邋ｎｇ／ｍｌ）作用下ＶＡＳＰ的表达，结果示ＶＡＳＰ表达较对照组明显的减少（图逡逑２Ｂ）。逡逑１０逡逑

在研究ＶＡＳＰ对心外膜脂肪细胞表型的影响前，首先我们进行小干扰ＲＮＡ逡逑技术沉默心外膜脂肪细胞ＶＡＳＰ。ＲＴ－ＰＣＲ及ＷＢ技术提示：ＬＶ－ｓｉＶＡＳＰ组成熟心外逡逑膜脂肪细胞较对照组（ＬＶ－ｓｉｃｎｔｒ）的ＶＡＳＰ的基因和蛋白表达明显减少（图３）。逡逑Ｅｎａ／ＶＡＳＰ家族促进肌动蛋白纤维的形成，对照组为长且有规律的肌动蛋白纤逡逑维，沉默ＶＡＳＰ后可见短且零乱的肌动蛋白形成（图４邋Ａ）。在ＶＡＳＰ沉默成功后，逡逑我们继续研宄了ＶＡＳＰ对心外膜脂肪细胞表型的影响。ＲＴ－ＰＣＲ检查结果提示：逡逑ＬＶ－ｓ邋ｉＶＡＳＰ组成熟心外膜脂肪细胞内ＵＣＰ－ｌ，邋ＰＲＤＭ１６基因表达逐渐减少，逡逑ｒｅｓｉｓｔｉｎ，ＲＩＰ１４０基因表达逐渐增加，差异有统计学意义（图４Ｂ，邋Ｐ〈０．邋０５），逡逑表明沉默ＶＡＳＰ促进棕色脂肪细胞白色化。接着我们进一步检测了在白介素－６逡逑（１００邋ｎｇ／ｍｌ）作用下ＶＡＳＰ的表达，结果示ＶＡＳＰ表达较对照组明显的减少（图逡逑２Ｂ）。逡逑１０逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

1 倪鸣;王金焱;王t

本文编号：2774958