ANO1抑制剂对SHR大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制探讨

发布时间：2020-07-30 01:31

【摘要】：研究目的:TMEM16A/Anoctamin-1(ANO1)是新发现的钙激活氯通道(calcium-activated chloride channel,CaCC),在心血管组织有广泛的表达。在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR),ANO1在血管组织和原代培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)表达明显增强,并参与血管功能和血压的调控。我们的前期实验发现:ANO1特异性抑制剂T16A(inh)-A01(A01)处理SHR-VSMC一天后,细胞增殖和迁移均被抑制。在此基础上,本研究进一步观察了ANO1抑制剂(A01)对VSMC增殖的抑制作用,并探讨了相关信号通路的变化。研究内容和方法:1.利用Western blot法检测SHR-VSMC上ANO1表达的变化。2.将ANO1抑制剂A01分别加入SHR-VSMC和WKY-VSMC处理24h或72h,通过MTT法观察A01对细胞增殖的抑制作用。3.将A01分别加入SHR-VSMC和WKY-VSMC处理24h,观察它对细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白水平的影响。4.利用PI(碘化丙锭)染色法,观察A01对VSMC细胞周期的影响。5.将A01加入SHR-VSMC和WKY-VSMC,观察A01对Erk通路的影响。6.将A01加入SHR-VSMC和WKY-VSMC,观察A01对Akt通路的影响。7.利用激光共聚焦显微镜及钙离子荧光染料,观察A01对细胞内钙水平的影响。实验结果:1.与WKY-VSMC相比,SHR-VSMC ANO1蛋白水平显著升高(P0.01)。2.MTT结果显示:与WKY-VSMC对照组相比,SHR-VSMC的活细胞数目明显增多,生长速度明显加快(P0.01)。与SHR-VSMC对照组相比,1-5μM A01处理24h对细胞增殖的抑制作用不明显,但是10-20μM A01导致细胞的活细胞数目减少(P0.05)。A01(5-20μM)作用72h后,A01抑制细胞增殖的效应更加明显(P0.01)。A01作用24h和72h对WKY-VSMC的增殖均无明显影响。3.与WKY-VSMC相比,SHR-VSMC的PCNA表达显著升高(P0.01)。A01(20μM)处理24h可部分抑制SHR-VSMC上PCNA的高表达(P0.05)。4.利用流式细胞仪和PI染色发现:与WKY-VSMC相比,SHR-VSMC出现G_1期比例下降的趋势,S期比例明显升高(P0.05)。A01(20μM)处理24h可导致SHR-VSMC的S期比例下降(P0.05)。但是在WKY-VSMC,A01的抑制作用并不明显。5.通过检测Erk蛋白发现:WKY-VSMC加入A01(20μM)作用5-60min,p-Erk表达有所下降但是没有统计学意义。而在SHR-VSMC,20μM A01可明显抑制Erk的激活,最大效应出现在加药后30-60min(P0.01)。当以不同浓度A01(1-20μM)处理WKY-VSMC 30min,p-Erk的表达并无明显改变,而10-20μM A01加入SHR-VSMC后,显著抑制了p-Erk的表达(P0.01)。以上结果提示A01抑制SHR-VSMC的Erk信号通路具有时间和剂量依赖性。6.通过检测Akt蛋白发现:20μM A01加入SHR-VSMC处理5-60min,p-Akt的表达无明显变化。不同浓度A01加入SHR-VSMC孵育30min,p-Akt水平和对照组相比无明显差异。不同于Erk信号通路,Akt通路可能不参与A01对SHR-VSMC增殖的抑制作用。7.利用激光共聚焦显微镜观察胞内Ca~(2+)的荧光成像。结果显示:与WKY-VSMC相比,SHR-VSMC可记录到更加强的Ca~(2+)荧光信号,而加入A01(20μM)后连续扫描2min,SHR-VSMC胞内的荧光强度明显降低(P0.05)但仍高于WKY-VSMC,提示A01能部分拮抗SHR-VSMC胞内钙的异常升高。结论:综上所述,ANO1抑制剂能明显抑制SHR-VSMC的异常增殖,该抑制作用可能与减少细胞周期中S期细胞比例,抑制Erk信号通路的激活以及降低胞内钙水平密切相关。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R544.11
【图文】：

血管平滑肌细胞

图 1 血管平滑肌细胞 ANO1 的表达Fig.1 Protein levels ofANO1 in VSMCultured SHR-VSMC and WKY-VSMC were used in this experdetected by western blot analysis after 24 hours of adherent ce ratio of target proteins to β-actin.**P<0.01 compared with the

细胞增殖

图 2 A01 处理 24h 和 72h 对细胞增殖的影响Fig.2 Effect ofA01 treatment on cell proliferationMC and WKY-VSMC were treated with different concentrations of A01(1, 5, 72h (B). The cell proliferation was detected by the MTT assay.##P<0.01 comcontrol,*P<0.05 compared with SHR-VSMC control,**P<0.01 compontrol, n=5.

血管平滑肌细胞,细胞周期,抑制剂

图 3 A01 对血管平滑肌细胞 PCNA 表达的影响Fig.3 Effect ofA01 on PCNA expression in VSMC) were incubated with the cells for 24h, then PCNA levels were dete<0.01 compared with the WKY-VSMC,*P<0.05 compared with the SH抑制剂 A01 对细胞周期的影响

【参考文献】