男性单核细胞中与雄激素受体相互作用的蛋白质相关研究

发布时间：2020-07-30 15:09

【摘要】：目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发病率正在逐渐增高,研究AS及其相关疾病的发病机制和防治方法成为热点。二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)是5α-还原酶还原睾酮双键形成的甾醇,是最具活性的雄激素。既往研究发现,生理水平的DHT可以显著减少巨噬细胞中血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1,LOX-1)的mRNA的表达,而且至少部分是通过雄激素受体(androgen receptor,AR)发挥作用的。为进一步探讨雄激素及其受体对动脉粥样硬化发生发展的作用,本课题小组前期通过酵母双杂交筛选出在男性外周血单核细胞内与AR相互作用的蛋白,得到核糖体蛋白L10(RPL10),前B细胞白血病同源框蛋白作用蛋白1(PBXIP1),但通过酵母双杂交并不能充分证实蛋白与蛋白间的作用,存在假阳性的可能。为此,本实验旨在利用pull down技术在体外对AR与上述蛋白的相互作用进行进一步验证,进而探讨在男性单核细胞中的蛋白与AR的相互作用的信号传导通路,可能作为辅助调节因子与AR之间存在相互作用,为动脉粥样硬化致病机制及治疗方向提供理论依据和靶点。研究方法:本研究采用基因克隆的技术,将pGADT_7-RPL10、pGADT_7-PBXIP1作为模板,设计特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段。将RPL10、PBXIP1基因片段,克隆到利用Eco R I和Bam H I两种限制性内切酶双酶切后的含有GST标签的pGEX_4T_2载体上,构建重组质粒pGEX_4T_2-RPL10与pGEX_4T_2-PBXIP1,进行测序并分析。利用诱导剂IPTG诱导大肠杆菌表达含有GST标签的蛋白RPL10与PBXIP1,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,考马斯亮蓝染胶,脱色观察蛋白表达情况。利用pull down技术,将pGBKT_7-AR重组质粒进行体外转录翻译,作为捕获蛋白;提取在大肠杆菌中表达的RPL10与PBXIP1蛋白,作为诱饵蛋白,将其固相化到MagneGST~TMM Particles上,将两种蛋白共同孵育,洗脱,纯化,利用Western blot技术分析相互作用的蛋白复合物,化学发光法鉴定结果并分析。结果:通过PCR技术获得目的基因片段,并重组质粒GST-RPL10、GST-PBXIP1构建成功。IPTG诱导RPL10、PBXIP1融合蛋白成功表达后,用pull down和Western blot技术证实,GST-RPL10融合蛋白大小约在50KD左右,GST-PBXIP1融合蛋白大小约在52KD左右,空白对照GST蛋白大小约在26KD左右,AR-LBD融合蛋白大小约在37KD左右;两种蛋白共同孵育后分别用不同抗体检测可见GST-RPL10/PBXIP1融合蛋白在体外可以特异性的将c-myc-AR-LBD融合蛋白pull down下来,空白对照GST蛋白不能将c-myc-AR融合蛋白pull down下来。结论:通过Pull down技术进一步证实AR编码蛋白分别与RPL10、PBXIP1在体外发生相互作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5
【图文】：

排序图,排序图,蛋白,诱饵

20）将EP管放入磁力架中，行磁力捕获，小心移除上清液，加入Magne GSTT结合/洗涤缓冲液 800ul，上下轻轻颠倒混匀。21）重复 20）步骤，一共进行 3 次洗涤。2、Western Blot 实验步骤1）利用 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒配制 12%分离胶和 5%浓缩胶。2）诱饵蛋白和捕获蛋白复合体沉淀加入 1×SDS 上样缓冲液 40ul，在 10pGBKT7- AR-LBD 捕获蛋白、10ul 诱饵蛋白中，各加入 2×SDS 上样缓冲液 10u混合均匀，放入水浴锅中，煮沸 5min。14000g，5min，4℃离心。3）在加样孔中分别加入捕获蛋白、共同孵育后的蛋白、诱饵蛋白等，进行电泳至染色带达边缘，设置电压：浓缩胶为 75V、分离胶为 130V。4）取出凝胶，量好尺寸，准备好大小相当的 PVDF 膜、滤纸，将 PVDF 膜在甲醇中浸湿 5min，按照“阴极-海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-阳极”，按下面的排序排好（图 1）。

片段,目的,条带,限制性内切酶

图 2 目的片段 PCR 结果A:代表 RPL10 片段,条带 1 大小与预期一致,测序分析,扩增成功,B:代表 PBXIP1 片段,条带 2 为 PBXIP1 片段;大小与预期一致,测序分析,扩增成功3.1.2 重组质粒构建利用限制性内切酶 EcoR I 和 BamH I，对载体 pGEX4T2进行双酶切，构建含有 GST 标签的重组质粒 pGEX4T2-RPL10 、pGEX4T2-PBXIP1，PCR 鉴定片段大小与预期相符，经测序分析，结果验证重组质粒构建成功（图 3）。A

重组质粒,PCR鉴定,条带

图 3 重组质粒的 PCR 鉴定结果A:代表重组质粒 pGEX4T2-RPL10,B:代表重组质粒 pGEX4T2-PBXIP1；条带大小均与目的条带大小相符，选取条带 2，7 测序分析，重组质粒构建成功3.2 体外验证 AR-LBD 编码蛋白与 RPL10、PBXIP1 编码蛋白间相互作用3.2.1 IPTG 诱导 RPL10、PBXIP1 表达蛋白将含有重组质粒 pGEX4T2- RPL10、pGEX4T2-PBXIP1 的大肠杆菌 DH5α中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 IPTG(终浓度 1mmol/L)，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，考马斯亮蓝 R250 染胶，脱色后观察到 RPL10、PBXIP1 融合蛋白成功表达。3.2.2 体外验证 AR-LBD 编码蛋白与 RPL10、PBXIP1 编码蛋白间相互作用

【参考文献】