miR-140靶向TLR4调节氧化应激状态下血管新生

发布时间：2020-08-01 07:10

【摘要】：目的:动脉粥样硬化是一种常见的大动脉性疾病,由动脉粥样硬化引起的急性心血管事件占据世界死亡因素的首位。血管新生贯穿于动脉粥样硬化易损斑块形成的全过程,是促进斑块不稳定性和诱导严重并发症发生的一大关键因素。氧化应激可以直接造成内皮损伤从而诱导血管新生的发生。microRNA是一类短的非编码小RNA,其可以通过调控与细胞生长、发育、分化、炎症、应激反应、凋亡等有关的mRNA来调节一系列细胞生物学功能的过程。研究表明,microRNA与动脉粥样硬化血管新生的形成密切相关,广泛参与了血管新生因子的调控,是研究和防治动脉粥样硬化斑块不稳定性的一个潜在靶点。本课题前期研究发现,TLR4可以促进内皮氧化损伤,诱导血管新生的发生,我们用生物信息学方法预测了可以调控TLR4的microRNA,并且发现miR-140在氧化应激的内皮细胞中表达具有显著性差异。本课题以人脐静脉内皮细胞和ApoE~(-/-)小鼠为研究对象,研究miR-140靶向TLR4调节氧化应激状态下血管新生的作用及机制,为临床对动脉粥样硬化血管新生诊断和治疗的新靶点奠定基础。方法:1、筛选最佳的LPC浓度,建立氧化应激HUVE-12细胞模型;2、制备过表达和沉默表达TLR4的慢病毒载体,包装成功后转染HUVE-12细胞,建立稳定表达TLR4的HUVE-12细胞,用RT-qPCR检测验证TLR4的转染表达效率,再用30μM LPC处理24 h诱导细胞氧化应激;3、制备过表达和沉默表达miR-140的质粒载体,瞬时转染HUVE-12细胞,用RT-qPCR检测验证miR-140的转染表达效率,再用30μM LPC处理24 h诱导细胞氧化应激;4、LDH和CCK8试剂盒检测HUVE-12细胞氧化应激损伤情况,以及TLR4和miR-140对细胞氧化应激损伤的影响作用;5、WB、IF、RT-qPCR检测氧化应激的HUVE-12细胞TLR4、VEGFA、miR140的表达情况,以及TLR4和miR-140对氧化应激的细胞TLR4、VEGFA、miR140表达的影响作用;6、Matrigel小管形成实验和CAM血管新生实验检测氧化应激的HUVE-12血管新生情况,以及TLR4和miR-140对氧化应激的细胞血管新生的影响作用;7、过表达或沉默表达TLR4的HUVE-12细胞,同时瞬时转染miR-140,再用30μM LPC处理24 h诱导细胞氧化应激;观察miR-140靶向TLR4调节氧化应激血管新生的作用;双萤光素酶报告基因验证miR-140和TLR4的靶向关系。8、6-7周龄SPF级ApoE~(-/-)和TLR4~(-/-)小鼠合笼杂交,建立ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠,筛选和鉴定小鼠基因型后,用高脂饲料喂养小鼠16周建立AS模型小鼠;9、检测AS小鼠血脂水平,用体式显微镜观察小鼠主动脉壁上斑块形成情况,HE染色观察斑块内病理组织结构,油红O染色检测斑块内脂质浸润情况,来观察TLR4对AS小鼠血脂水平以及脂质斑块形成的影响作用;10、IHC、IF检测AS小鼠VEGFA、VEGFAR2、vWF表达量,观察TLR4对AS小鼠斑块血管新生的影响作用;11、RT-qPCR、WB检测观察AS小鼠TLR4、VEGFA、miR-140的表达量;12、Masson染色检测AS小鼠斑块内胶原纤维含量,观察TLR4对AS小鼠斑块稳定性的影响作用;13、Pearson相关性分析法分析在AS小鼠中miR-140、TLR4、VEGFA之间的相关性。结果:1、30μM LPC为最佳的氧化应激细胞造模浓度;2、氧化应激的HUVE-12细胞TLR4和VEGF表达量增高,miR-140表达量降低;3、氧化应激的HUVE-12诱导血管新生增强;4、荧光显微镜下观察转染的细胞荧光表达率在90%以上,与空载对照组比较,过表达TLR4的细胞TLR4表达量升高约70倍,沉默表达TLR4的细胞TLR4表达量降低约50倍;5、与空载对照组比较,miR-140过表达细胞的miR-140表达量升高约20倍,miR-140沉默表达的细胞miR-140表达量降低约10倍6、过表达TLR4促进氧化应激的细胞氧化应激损伤、小管形成和CAM血管新生,增加VEGFA的表达量、降低miR-140表达量;沉默表达TLR4减少氧化应激的细胞氧化应激损伤、小管形成和CAM血管新生,降低VEGFA的表达量、增加miR-140表达量。7、过表达miR-140减少氧化应激的细胞氧化应激损伤、小管形成和CAM血管新生,减少TLR4、VEGFA的表达量;沉默表达miR-140促进氧化应激的细胞氧化应激损伤、细胞小管形成和CAM血管新生,增强VEGFA、TLR4的表达量。8、过表达miR-140减少过表达TLR4的氧化应激细胞的氧化应激损伤、小管形成和CAM血管新生,降低TLR4、VEGFA表达量降低;过表达miR-140对沉默表达TLR4的氧化应激细胞的氧化应激损伤、小管形成和CAM血管新生以及VEGFA表达量无明显统计学差异。9、双萤光素酶结果显示,miR-140显著抑制TLR4报告基因萤光信号,相应结合位点突变后,TLR4报告基因萤光信号上调。10、琼脂糖凝胶电泳结果显示ApoE~(-/-)和ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠分别在254、140bp条带处显影。11、高脂饲养小鼠16周后,ApoE~(-/-)和ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)小鼠主动脉壁上均有斑块形成并合并不同程度的脂质浸润,且小鼠血脂水平升高。12、ApoE~(-/-)/TLR4~(-/-)组小鼠较ApoE~(-/-)组小鼠主动脉壁上粥样硬化斑块形成和脂质浸润减少,血脂水平降低,VEGFA、VEGFR2、vWF表达量降低,miR-140表达量增高,斑块内胶原纤维含量增高;13、相关性分析结果显示TLR4与VEGFA表达量呈正相关性,miR-140与TLR4、VEGFA的表达量均为负相关性。结论:1、TLR4促进氧化应激诱导的血管新生。2、miR-140靶向负调控TLR4抑制氧化应激诱导的血管新生。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54
【图文】：

氧化应激,细胞模型

1.3.1 氧化应激诱导血管新生1.3.1.1 氧化应激细胞模型的建立在本实验中，分别用 5、10、20、30、50、100μM 浓度的 LPC 处理 HUVE-12细胞 24 小时后，LDH 试剂盒检测细胞氧化应激损伤情况，结果显示，与 NC 组比较，在 30μM 浓度时细胞 LDH 释放量开始呈浓度梯度升高而增高（NC:8.296±0.246，30μM:13.020±0.656，50μM:20.756±0.265，100μM:33.883±0.220，P＜0.05）（图 1-1A）；CCK8 检测细胞增殖活力，实验结果显示细胞增殖活力在30μM 浓度时开始呈浓度梯度升高而下降（NC: 6.456±0.4081，30μM:4.92±0.317，50μM:2.866±0.221，100μM:2.0967±0.198，P＜0.05）（图 1-1B），在50μM 浓度后细胞增殖活力明显受到抑制而不利于后续实验的进行，因此在本课题实验中选用 30μM 浓度的 LPC 诱导损伤 HUVE-12 细胞，建立氧化应激损伤模型细胞，此浓度也与本课题组前期实验中的浓度一致。

氧化应激,细胞,血管新生,硕士学位论文

硕士学位论文1.3.1.2 氧化应激的 HUVE-12 细胞 TLR4、VEGFA 表达量增高，miR-140表达量降低（1） WB 检测细胞 TLR4、VEGFA 蛋白的表达量上述结果中可得知氧化应激状态下可以促使 HUVE-12 细胞血管新生增强，为了进一步研究其机制，我们首先用 WB 检测了 TLR4 的表达量，结果显示 LPC30μM 组较 NC 组 TLR4 的表达量明显增高（NC: 157.333±5.033，LPC 30: 213±7.211，P＜0.05）；此外检测 VEGFA 蛋白的表达量，结果显示 LPC 30μM 组较 NC 组 VEGFA 表达量亦显著增高（NC: 167±8.185，LPC 30: 217±5.567，P＜0.05）（图 1-2）。

氧化应激,细胞,氧应激,诱导细胞

图 1-3 IF 检测氧化应激的 HUVE-12 细胞内 VEGFA 蛋IF detection of oxidative stress in VEGFA protein expression of VEGFA protein in LPC 30μM group is increased, bin (Alexa Fluor594 fluorescent secondary antibody), 40X, scal group, P < 0.05.qPCR 检测细胞 TLR4、VEGFAmRNA 的表达量和PCR 结果显示，用 30μM LPC 诱导细胞氧应激后，mRNA 的表达量升高（NC: 1，LPC 30: 2.95±0.03，P 组较 NC 组 VEGFA mRNA 的表达量亦升高（NC0.05）（图 1-4B），LPC 30μM 组较 NC 组 miR-141，LPC 30: 0.38±0.03，P＜0.05）（图 1-4C）。

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