NANOG对胸主动脉夹层中平滑肌细胞表型转化的调控作用及机制研究

发布时间：2020-08-03 15:22

【摘要】：研究背景及目的:胸主动脉夹层(Thoracic aortic dissection,TAD)是一种死亡率极高的主动脉急症。TAD发生时,主动脉内膜出现破口,破口处血液流入并导致主动脉中层撕裂成真假两腔,因假腔内血液无法及时有效排出,血液在假腔内不断累积并最终导致假腔破裂,病人急性死亡。若不给予积极干预,TAD起病后的48小时内约有50%的患者死亡。一些遗传性疾病如马凡氏综合征、Ehlers-Danlos综合征等可以引起TAD,但只有大约10%的TAD为遗传性疾病引起。目前非遗传性TAD的具体发病机制仍未能阐明,并且对于TAD尚无有效的预防及药物治疗手段。因此,对TAD发病机制的研究有利于在此基础上探寻TAD的早期预防和药物治疗方法。已知主动脉壁中层是主动脉的主要功能结构,主动脉中层的功能异常是TAD发生的重要病理生理基础。主动脉中层的主要细胞成分是血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs),其存在收缩型与合成型两种表型。与收缩型相比,合成型VSMCs表现为更强的增殖、迁移能力以及高表达骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、细胞外基质蛋白如基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP2)及基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9),而收缩型VSMCs标志物α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)与平滑肌蛋白22α(Smooth muscle 22α,SM22α)的表达水平则显著下降。生理情况下主动脉内VSMCs主要以收缩型存在,维持主动脉的正常功能。多项研究已经表明VSMCs由收缩型向合成型的表型转化参与了TAD的发生,在TAD的病理生理过程中有重要作用。然而,目前对于TAD中VSMCs表型转化的具体机制仍然了解甚少。NANOG是一种在维持胚胎干细胞增殖及全能性方面有重要作用同源域蛋白。在胚胎干细胞中,NANOG的持续表达可以维持其自我更新潜能及去分化状态。相对的,NANOG的低表达可以引起胚胎干细胞分化。VSMCs由收缩型向合成型转化被认为是一种去分化过程,故NANOG在干细胞中的功能高度提示其可能与VSMCs的表型转化相关。但NANOG在TAD中VSMCs表型转化中的作用尚未见有报道。OPN蛋白高表达于TAD组织及合成型VSMCs。目前研究表明OPN直接促进了VSMCs由收缩型向合成型的转化,高表达的OPN能够增强VSMCs的增殖和迁移能力,上调VSMCs中合成型标志物MMP2的表达并下调收缩型标记物α-SMA的表达。同时,有研究报道在胚胎干细胞中OPN的表达受NANOG调控,这高度提示了NANOG可能通过调控OPN参与了TAD中VSMCs的表型转化。本研究的目的是通过组织学及分子生物学的方法探究NANOG对TAD中VSMCs表型转化的调控作用及其机制。研究方法:(一)TAD标本的收集与VSMCs的分离1.主动脉临床标本的收集:TAD组主动脉组织来自20例接受手术修复的TAD患者;正常对照组主动脉组织来自10例未患有主动脉及血管相关疾病的捐献者。2.VSMCs的分离与培养:原代VSMCs分离自TAD组以及对照组来源标本。标本离体经去除内外膜后剪切为约4mm~2大小组织块,接种于24孔板,每孔加入200μl含有生长添加剂的M231培养基后经贴壁培养取得原代VSMCs。原代VSMCs生长至融合时进行传代,组织块则转移至新的孔板中继续分离细胞。(二)NANOG对VSMCs表型转化的调控作用及机制1.腺病毒转染:VSMCs生长至汇合率约70%时,取半量培养基根据MOI加入适量体积的腺病毒制成感染培养基,加入感染培养基37℃下孵育2小时后补足培养基,孵育过夜后更换至不含病毒培养基,24小时后荧光显微镜下观察转染效果。2.siRNA转染:根据Lipofectamine 2000脂质体转染试剂的操作手册进行siRNA转染。3.免疫组织化学:主动脉组织经10%福尔马林固定、脱水、石蜡包埋后切片,组织切片经脱蜡、抗原修复、抑制内源性过氧化物酶、封闭、孵育一抗及二抗后采用DAB显色液显色。4.qRT-PCR与Western blot:qRT-PCR用于检测样本中目的基因mRNA表达水平,Western blot用于检测样本中目的蛋白表达水平。5.细胞增殖实验:采用CCK8法检测VSMCs增殖水平。6.划痕实验:划痕实验用于检测细胞的水平方向迁移能力。7.Transwell迁移实验:Transwell迁移实验用于检测细胞的垂直方向趋化迁移能力。8.Annexin V/PI双标记流式细胞凋亡实验:紫外线照射(10J/m~2)被用于诱导VSMCs凋亡,细胞经Annexin V/PI双标记后通过流式细胞术定量分析凋亡细胞的比例。9.TUNEL细胞凋亡实验:VSMCs经4%多聚甲醛固定、透膜后加入生物素标记的dUTP与脱氧核糖核苷酸末端转移酶孵育,最后经荧光染色后荧光显微镜下检测凋亡细胞比例。10.免疫荧光:VSMCs经75%乙醇水溶液固定后,经透膜、封闭、一抗及二抗孵育、染核后荧光显微镜下观察。11.染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP):根据EpiQuik ChIP试剂盒中的操作手册所提供的步骤进行ChIP实验。(三)实验数据的统计分析数据采用非配对Student t检验。统计学分析均在SPSS中完成。数据以均数±标准差的形式呈现。P小于0.05认为在统计学上存在显著性差异。研究结果:(一)TAD来源的主动脉组织及VSMCs中高表达NANOG,同时伴随有VSMCs表型转化qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学的结果显示TAD主动脉组织中NANOG的mRNA及蛋白水平均显著上调,同时伴随着VSMCs合成型标志物OPN与MMP2的表达上调及收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达下调。进一步对VSMCs的检测在细胞水平上验证了上述发现,细胞免疫荧光结果显示TAD来源VSMCs中高表达的NANOG主要分布于细胞核,同时伴随着胞浆中OPN的表达升高与SM22α的表达降低。本部分的结果说明NANOG可能参与调控了TAD中VSMCs表型转化。(二)NANOG促进了VSMCs由收缩型向合成型的表型转化VSMCs中过表达NANOG上调了VSMCs合成型标志物OPN与MMP2的表达并下调了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达。同时,CCK8增殖实验结果显示过表达NANOG增强了VSMCs的增殖能力。划痕实验与Transwell迁移实验结果显示过表达NANOG增强了VSMCs在水平方向和垂直方向的迁移能力。流式细胞凋亡实验结果表明NANOG的过表达增强了VSMCs的抗凋亡能力。TUNEL实验的结果验证了流式细胞凋亡实验的结果,NANOG过表达组的VSMCs凋亡比例较对照组显著下降。进一步的研究结果显示在TAD来源的VSMCs中干扰敲低NANOG的表达上调了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达同时下调了合成型标志物OPN与MMP2的表达。本部分的结果说明高表达的NANOG可以调控VSMCs由收缩型向合成型转化,并且这一功能可能是通过OPN实现。(三)NANOG通过直接上调OPN的表达促进了VSMCs由收缩型向合成型转化ChIP实验结果显示NANOG可以直接结合至OPN基因的启动子区域。在进一步的拯救实验中,在过表达NANOG的VSMCs中敲低OPN引起了收缩型标志物α-SMA与SM22α的表达上调,同时合成型标志物MMP2的表达水平下调。CCK8增殖实验、划痕实验、Transwell迁移实验、流式凋亡实验及TUNEL实验的结果显示敲低OPN阻止了过表达NANOG引起的VSMCs增殖、迁移及抗凋亡能力增强。本部分的结果说明NANOG通过直接上调OPN的表达促进了TAD中VSMCs的表型转化。研究结论:我们的研究结果说明NANOG高表达于TAD患者的主动脉组织及VSMCs,高表达的NANOG通过直接上调OPN的表达促进了VSMCs由收缩型向合成型转化。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.1
【图文】：

对照组,主动脉组织,主动脉,军医大学

军军医大学博士学位论文h）、弃掉板孔内的 DAPI，PBS 冲洗三次。取出细胞爬片并使用防淬灭封片液后置于正置荧光显微镜下观察，记录典型图像。拍照完成的细胞爬片应保存在-20缓荧光粹灭。二、结果（一）NANOG 在 TAD 主动脉中的表达水平较正常主动脉显高本部分中，首先用 qRT-PCR 与 Western blot 的方法检测了 TAD 主动脉组织及对照组织中 NANOG 的 mRNA 及蛋白表达水平，结果发现 TAD 主动脉组织ANOG 的 mRNA 及蛋白表达水平显著高于正常对照主动脉（图 1-1）。

主动脉,主动脉组织,对照组,合成型

1-2 对照组与 TAD 组主动脉中的 NANOG 免疫组织染色。（二）TAD 主动脉组织中的 VSMCs 由收缩型向合成型表型1、TAD 主动脉组织中合成型 VSMCs 的标志物表达水平升高qRT-PCR 以及 Western 的结果显示 TAD 主动脉组织中 VSMCs 合成型的标志PN 及 MMP2 的 mRNA 及蛋白表达水平较正常对照组显著上调（图 1-3）。

免疫组织,对照组,主动脉组织,主动脉

对照组与TAD组主动脉中的NANOG免疫组织染色

【参考文献】