FGF-2转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

发布时间：2020-08-06 13:34

【摘要】：由于成体心肌细胞是终末分化细胞,缺血性心脏病引起的心肌损伤不能通过自身再生来修复,因此挽救梗死的心肌组织,恢复其原有的功能是治疗缺血性心脏病的关键。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是常见的"种子细胞"。BMSCs在一定条件的诱导下,可以向多个方向分化,如成脂肪、骨、肌肉、神经、心肌、内皮等多类细胞组织,BMSCs还可以作为根源细胞来延缓衰老和修复疾病损伤的组织及器官。将诱导分化为心肌细胞样细胞的骨髓间充质干细胞,植入受损的心肌组织,对修复心肌损伤具有一定的作用。成纤维细胞生长因-2(Fibroblastgrowthfactor-2,FGF-2)是广泛分布于体内各种组织中的多功能生长因子。它具有刺激各类干细胞的迁移、增殖、分化,促进新生血管形成和保护心脏的作用。随着转基因技术的不断发展,通过基因转染的方式改造干细胞已成为干细胞研究领域的热点。在基因修饰中,慢病毒载体是应用最广泛的基因载体,与质粒、腺病毒等载体相比,它具有转染效率高、细胞毒性低、目的基因表达时间长等优势。本研究通过构建慢病毒载体将FGF-2基因转染到BMSCs中,转染BMSCs过表达FGF-2基因。探究FGF-2在BMSCs向心肌样细胞分化过程中的作用,比较基因转染是否优于直接诱导。期待借此提升细胞的分化效率,为临床通过心肌细胞移植治疗缺血性心脏病提供优良的细胞来源。为探讨慢病毒介导FGF-2转染诱导BMSCs向心肌样细胞分化的效率是否优于FGF-2直接诱导,本实验首先采用全骨髓贴壁法体外无菌条件下分离、培养BMSCs,对扩增纯化后的细胞进行形态学观察,结果显示,BMSC在6h后开始粘附并在24h后附着,此时细胞呈圆形并且具有较强的折光性;2d后,大部分细胞已经贴壁,大多数是短纺锤形,也有少部分细胞呈不规则形;4d后,细胞体积开始变大,球形细胞逐渐减少;7d后细胞体积逐渐变大并开始向周围扩散,细胞大致呈平行排列。利用流式细胞技术对培养至第4代BMSCs进行鉴定,结果表明,CD45的阳性表达率为4.6%;CD29的阳性表达率为98.2%,CD90的阳性表达率为91.8%,符合BMSCs的特征。经鉴定,培养至第4代的细胞为纯化的BMSCs。诱导前,对FGF-2直接诱导的最佳诱导浓度和慢病毒转染诱导的最适病毒MOI值进行筛选,通过预实验得知,FGF-2的最佳诱导浓度可能为1ng/ml,Lenti-FGF-2-GFP慢病毒最适转染MOI值为150和Lenti-对照-GFP慢病毒最适转染MOI值为100。对培养至第2代的细胞加入诱导剂,诱导72h后进行换液,更换为不含诱导剂的IMDM培养基继续培养。根据加入诱导剂的不同分为以下4组:A组(BMSCs空白对照组)、B组(FGF-2诱导组)、C组(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒转染组)、D组(Lenti-对照-GFP慢病毒转染组)。诱导前通过预实验确定最佳细胞诱导密度、最佳诱导浓度、最佳诱导时间。Real-timePCR检测心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2.5的表达,实验结果表明,GATA-4、Nkx2.5在各组细胞中均有表达。GAPDH作为内参对照,利用相对定量分析判断GATA-4、Nkx2.5基因的表达情况。结果显示,与A组(BMSCs空白对照组)相比,B组(FGF-2诱导组)、C组(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒转染组)诱导4W后GATA-4、Nkx2.5基因的表达增强。其中,C组(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒转染组)的GATA-4及Nkx2.5基因的相对表达量在各时间点均高于其他实验组。免疫细胞化学染色法及免疫荧光化学染色法检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、间隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)、结蛋白(Desmin)、原肌球蛋白(Tropomyosin,Tm)的表达情况,结果显示,诱导4W后,cTnI、cTnT、Cx43、Desmin、Tm在各组细胞的胞质中可见阳性表达。统计分析显示,C组(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒转染组)中标记物的积分光密度(IOD)值最强。A组(BMSCs空白对照组)D组(Lenti-对照-GFP慢病毒转染组)的Cx43和cTnI呈弱阳性或阴性表达。各诱导组间各标记物的阳性表达存在显著性差异。Western blot检测原肌球蛋白(Tropomyosin,Tm)及结蛋白(Desmin)的表达情况,结果显示,诱导4W后A组(BMSCs空白对照组)、B组(FGF-2诱导组)、C组(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒转染组)、D组(Lenti-对照-GFP慢病毒转染组)中Tm及Desmin均有表达,其中C组(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒转染组)的Desmin阳性表达率高于其他实验组,B组(FGF-2诱导组)、C组(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒转染组)Tm的表达高于A组(BMSCs空白对照组)和D组(Lenti-对照-GFP慢病毒转染组)。统计分析,各实验组Desmin的阳性表达差异均有统计学意义,B组(FGF-2诱导组)、C组(Lenti-FGF-2-GFP慢病毒转染组)Tm的表达无显著差异。透射电镜结果显示,经FGF-2慢病毒转染诱导后的BMSCs细胞核呈卵圆形,位于细胞的中央,细胞质内可见肌丝、粗面内质网、线粒体、核糖体等细胞器。符合心肌细胞发育过程中的结构特征。由此实验可知:(1)FGF-2可转染诱导BMSCs向心肌样细胞分化。(2)慢病毒介导FGF-2转染诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的效率优于FGF-2直接诱导。
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541

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