动脉粥样硬化铁脂代谢紊乱机制研究

发布时间：2020-08-07 13:34

【摘要】：第一部分动脉粥样斑块铁沉积及局灶铁调素自分泌的介导机制研究目的:探讨斑块巨噬细胞铁调素(Hepcidin)自分泌介导的铁沉积在动脉粥样硬化(AS)斑块形成中的作用及其潜在分子机制方法:将40只ApoE~(-/-)雌性小鼠随机分为普通饲料组(ND)、高脂饲料组(HFD),每组20只,并以15只相同遗传背景下的野生型C57BL/6J小鼠为对照组(WT)。喂养16周后,收集各组主动脉组织并进行主动脉整体油红O染色和主动脉弓横截面HE染色以评价各组小鼠AS斑块形成情况;采用免疫荧光双染法及免疫组化实验分别对人颈动脉和各组小鼠AS斑块中的巨噬细胞和ox-LDL、TLR4、p-p65、Hepcidin及ferritin-L进行共定位染色;荧光定量PCR检测各组小鼠主动脉斑块组织中TLR4、Hepcidin、甘露糖受体及ferritin-L的基因转录水平。根据实验目的,对RAW264.7巨噬细胞进行不同处理,包括转染Hepcidin siRNA及Control siRNA以及ox-LDL、TLR4信号通路激活剂(LPS)和抑制剂(TAK-242)、Hepcidin、柠檬酸铁胺(FAC)、铁螯合剂(DFO)、27-羟基胆固醇(27HC)及环孢菌素A(Cyclosporin A)的干预。Western blot检测TLR4、p-p65、Hepcidin、ferritin-L、铁蛋白重链(ferritin-H)、胆固醇27-羟化酶(CYP27A1)及系列胆固醇摄取及外流相关蛋白表达水平;检测各实验组细胞可变铁池;对细胞进行油红O染色、测定细胞总胆固醇和游离胆固醇水平并进行细胞胆固醇外流实验和ox-LDL摄取实验。结果:1)主动脉整体油红O染色和主动脉弓横截面HE染色结果显示,与WT和ND组相比,HFD组小鼠主动脉斑块损伤面积增加约72%(P0.05)。与WT和ND组相比,ox-LDL、TLR4、p-p65、Hepcidin、ferritin-L与巨噬细胞在HFD组小鼠主动脉斑块中的共定位更为广泛,且多见于斑块泡沫细胞聚集处。此外,HFD组小鼠主动脉斑块组织中TLR4、Hepcidin、ferritin-L及甘露糖受体(巨噬细胞标记)的mRNA水平显著高于ND和WT组(P0.05),且Hepcidin mRNA水平分别与甘露糖受体、TLR4及ferritin-L基因转录水平间存在正相关关系(P0.01)。2)RAW264.7巨噬细胞中,ox-LDL(50μg/mL)可诱导TLR4、p-p65及Hepcidin蛋白表达水平分别升高约55%、34%和48%(P0.05),并使细胞ferritin-L、ferritin-H蛋白表达水平分别上调约60%和42%(P0.05),细胞内游离铁水平升高约48%(P0.05),并增加细胞内脂质蓄积水平。上述指标在使用LPS特异性激活TLR4/NF-κB信号通路后进一步显著上升(P0.05);而TAK-242(TLR4抑制剂)的作用则完全相反(P0.05)。3)对转染了Hepcidin siRNA的巨噬细胞进行ox-LDL处理使细胞TLR4和p-p65蛋白表达较Control siRNA组分别上升了约41%和34%(P0.05),并可与FAC联合作用进一步显著上调TLR4、p-p65蛋白表达水平,加速细胞泡沫化,表现为油红O染色面积及细胞内总胆固醇和游离胆固醇水平显著上升,且由HDL和ApoAⅠ介导的胆固醇流出率较Control siRNA组分别下降了35%和68%(P0.05);相反,在经Hepcidin预处理的巨噬细胞中,采用DFO螯合细胞内铁则可显著下调细胞TLR4及p-p65蛋白表达,并有效拮抗ox-LDL对TLR4和p-p65蛋白表达的诱导作用,且伴有细胞泡沫化水平显著降低。4)Hepcidin干预可显著下调巨噬细胞CYP27A1蛋白表达(仅为对照组的50%,P0.05),诱导CD36表达(较对照组上升了约31%,P0.05)促进胆固醇摄取,并使LXRα、ABCA1及ABCG1表达较对照组分别下降了约31%、29%和37%(P0.05),减少巨噬细胞胆固醇流出,增加细胞内胆固醇水平(约为对照组的1.4倍,P0.05)。结论:Ox-LDL通过激活TLR4/NF-κB信号通路引发的AS斑块巨噬细胞Hepcidin自分泌是斑块铁沉积发生的重要诱因。巨噬细胞Hepcidin自分泌诱导的细胞内铁潴留可反向激活TLR4/NF-κB信号通路,并由此形成由TLR4/NF-κB信号通路介导的Hepcidin自分泌-铁潴留恶性循环,进而诱发CYP27A1/27HC轴调节障碍,扰乱由CD36及PPARγ-LXRα-ABCA1/G1共同维持的巨噬细胞胆固醇稳态而加速细胞泡沫化。第二部分高脂高铁膳食对动脉粥样硬化模型小鼠铁脂代谢的影响:i TRAQ蛋白质组学研究分析目的:通过高脂高铁膳食喂养Apo E-/-小鼠,对动脉粥样硬化“铁假说”进行验证,并运用i TRAQ蛋白质组学方法探讨膳食高脂高铁对Apo E-/-小鼠铁脂代谢的影响及潜在分子机制。方法:将60只Apo E-/-雌性小鼠随机分为普通饲料组(ND)、高脂饲料组(HFD)及高脂高铁饲料组(HFD+Fe),每组20只,并以15只相同遗传背景下的野生型C57BL/6J小鼠为对照组(WT)。喂养16周后,收集各组主动脉及肝脏组织并进行组织病理学检测;测定血脂、血清铁水平及血清β-羟基丁酸、乳酸、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平。检测肝脏脂质水平,总铁含量及ATP、乙酰辅酶A及氧化损伤与细胞凋亡水平。提取ND、HFD及HFD+Fe组小鼠肝脏总蛋白,经酶解后,使用i TRAQ试剂进行标记,随后取等量的各标记样品进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析及检测、数据处理与深入的生物信息学分析。采用荧光定量PCR、Western blot及相关生化指标检测等方法对相关蛋白质组学分析结果进行验证。提取并培养原代小鼠肝细胞。单独使用游离脂肪酸(FFA)或联合柠檬酸铁胺(FAC)处理肝细胞,检测各组细胞TG水平。Western blot及免疫荧光法检测细胞CD36及脂肪酸结合蛋白(FABP)家族蛋白表达水平,检测各实验组细胞对游离脂肪酸的摄取能力。免疫荧光双染法检测细胞中游离脂肪酸与内质网的共定位。结果:1)HFD+Fe组小鼠主动脉斑块面积与HFD组相比下降了近65%(P0.05),血清TC、TG及LDL-C水平分别较HFD组降低了约25%、30%和70%(P0.05),且该组小鼠肝脏TC和TG水平仅约为HFD组的65%和70%(P0.05)。2)HFD+Fe组小鼠血清铁、肝脏总铁及铁蛋白表达水平较HFD组升高了约42%、51%和57%(P0.01),肝脏普鲁士蓝呈现大面积蓝染。3)小鼠肝脏i TRAQ蛋白质组学分析结果显示,HFD与ND组间差异表达蛋白共计333种(变化倍数1.5或0.67,P0.05),这些蛋白主要参与的代谢通路包括脂肪酸代谢、脂肪酸降解、过氧化物酶体及谷胱甘肽代谢等。HFD+Fe与HFD组间差异表达蛋白共计203种,其主要参与的KEGG通路包括三羧酸(TCA)循环、丙酮酸代谢、谷胱甘肽代谢和脂肪酸降解等。4)与ND组相比,HFD小鼠肝脏FASN和磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC)表达分别下降了约55%和65%(P0.05);乙酰辅酶A脱氢酶(ACADS)、乙酰辅酶A乙酰转移酶(ACAT1)及过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)等表达分别上升了约64%、88%和95%(P0.01)。相反,HFD+Fe与HFD组相比,其肝脏内源性脂肪酸合成通路呈显著性增强状态[FASN、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)表达分别上升了约85%和70%(P0.05)],而脂肪酸β氧化通路明显受阻[ACADS、ACAT1、PPARα及羟基辅酶A脱氢酶(HADH)表达显著下调,血清β羟基丁酸水平下降约63%(P0.05)]。5)与HFD组相比,HFD+Fe组小鼠肝脏中参与脂肪酸摄取与转运的CD36、肝脏型脂肪酸结合蛋白(FABP1)和小肠型脂肪酸结合蛋白(FABP2)蛋白表达分别下降了约75%、57%和52%(P0.05),且血清游离脂肪酸水平升高了约35%(P0.05)。体外细胞实验结果表明,柠檬酸铁铵处理原代小鼠肝细胞可显著降低肝细胞脂质蓄积水平(P0.05),抑制CD36和FABP1的蛋白表达(P0.05),引发细胞脂肪酸摄取和转运障碍。6)与HFD组相比,HFD+Fe组小鼠肝脏TCA循环中的关键酶表达水平呈显著性下降(P0.05),包括丙酮酸脱氢酶β、二氢硫辛酸脱氢酶、顺乌头酸酶1、线粒体苹果酸脱氢酶和延胡索酸水合酶等。同时,肝脏乙酰辅酶A和ATP水平在HFD+Fe组均出现显著性下降,仅约为HFD组的54%和65%(P0.05)。7)HFD+Fe组小鼠肝脏出现一定程度氧化损伤。表现为亮氨酸氨基肽酶3、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽过氧化酶1和谷胱甘肽S-转移酶3表达水平显著下降(P0.05);肝脏蛋白质发生4-HNE修饰的程度显著增加;肝脏MDA水平较HFD组升高约34%(P0.05)而SOD和GSH水平较HFD组分别下降了约64%和31%(P0.05);肝脏细胞凋亡水平明显增加,伴有血清AST和ALT水平较HFD组分别升高了约35%和30%(P0.05)。结论:高铁高脂膳食喂养可诱发Apo E-/-小鼠系统铁脂代谢紊乱,造成由CD36和FABP家族介导的肝脏脂肪酸摄取和转运障碍,及以线粒体脂肪酸β氧化和TCA循环通路受损为主要表现的能量代谢障碍,而在此情况下伴发的主动脉AS斑块减少这一“改善假象”实为肝脏脂肪酸代谢障碍及能量不足导致肝脏“隐匿性损伤”加重的表现。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R543.5
【图文】：

图 1.1 实验期间各组小鼠体重变化趋势注：与 WT 组相比，aP＜0.05；与 ND 组相比，bP＜0.052 各组实验小鼠 AS 斑块形成情况评价.1 小鼠主动脉整体油红 O 染色结果如图 1.2 所示，WT 组小鼠主动脉管腔内壁光滑且基本无肉眼可见的红，ND 组小鼠主动脉弓及双侧髂动脉分支部位血管内壁稍显粗糙，经油红可见少量红染的 AS 斑块，主动脉其他各段未见明显斑块附着。与 WT组相比，HFD 组小鼠主动脉弓部位以及髂动脉分支处可见较大范围的 着，且管腔其他部位亦有散在、不连续斑块分布。利用 Image-Pro Plus 斑块面积占主动脉整体面积的百分比对各组小鼠主动脉 AS 斑块面积进析，结果显示：与 WT 组和 ND 组相比，HFD 组小鼠主动脉内壁的 AS显著增加，且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

图 1.2 各组小鼠主动脉整体油红 O 染色图片及定量分析结果注：与 WT 组相比，aP＜0.05；与 ND 组相比，bP＜0.05；n=4。1.2.2.2 小鼠主动脉弓横截面 HE 染色结果如图 1.3 所示，WT 组小鼠主动脉内膜光滑完整，管腔内未见赘生物；ND 组小鼠主动脉内膜可见 定程度增生且伴有明显斑块附着，斑块内可见大量泡沫细胞及无结构状坏死物；与 ND 组相比，HFD 组小鼠主动脉血管结构破坏严重，斑块内泡沫细胞聚集情况更为明显且伴有大量炎症细胞浸润及胆固醇结晶形成。

图 1.2 各组小鼠主动脉整体油红 O 染色图片及定量分析结果注：与 WT 组相比，aP＜0.05；与 ND 组相比，bP＜0.05；n=4。1.2.2.2 小鼠主动脉弓横截面 HE 染色结果如图 1.3 所示，WT 组小鼠主动脉内膜光滑完整，管腔内未见赘生物；ND 组小鼠主动脉内膜可见 定程度增生且伴有明显斑块附着，斑块内可见大量泡沫细胞及无结构状坏死物；与 ND 组相比，HFD 组小鼠主动脉血管结构破坏严重，斑块内泡沫细胞聚集情况更为明显且伴有大量炎症细胞浸润及胆固醇结晶形成。

本文编号：2784065