钙通道相关基因CASQ2与RYR2在二乙酰吗啡致心律失常中的作用研究

发布时间：2020-08-09 04:20

【摘要】：目的:研究钙通道相关基因CASQ2和RYR2在二乙酰吗啡致心律失常中的作用及意义。方法:离体培养原代大鼠乳鼠心肌细胞,以不同浓度二乙酰吗啡作用于心肌细胞,观察心肌细胞形态和自发性搏动频率及节律改变。采用膜片钳技术检测二乙酰吗啡干预后心肌细胞动作电位及钙离子通道改变。实验分3组:对照组(N组)、二乙酰吗啡组(H组)、二乙酰吗啡+维拉帕米组(H+V组)。采用免疫荧光技术对各组细胞中的CASQ2和RYR2蛋白荧光强度进行检测。通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法分别检测各组细胞中的CASQ2和RYR2基因的mRNA和蛋白表达量。结果:不同浓度的二乙酰吗啡作用于原代大鼠乳鼠心肌细胞后,随着二乙酰吗啡浓度升高,心肌细胞形态变化明显,细胞数量减少,细胞体积缩小,伪足数量减少;细胞核形态改变,结构模糊;心肌细胞自发性搏动频率及节律改变,结果有统计学意义(P0.05)。二乙酰吗啡作用于心肌细胞后,L型钙通道电流I-V曲线上移,峰值与对照组相比明显降低(对照组-14.4687?3.6107,实验组组-4.9662?0.7708(24h)、-3.7570?2.0602(48h)),动作电位中APD90显著增加,RP负值降低,APA显著减小,结果有统计学意义(P0.05)。免疫荧光检测发现,N组CASQ2主要表达于细胞质,RYR2主要表达于细胞核;H组CASQ2在细胞质内表达降低而细胞核表达升高,RYR2在细胞核表达降低而细胞质内表达升高;H+V组CASQ2在细胞核和细胞质位置均有表达,RYR2在细胞核表达减少,在细胞质少量表达;与N组相比,H组和H+V组CASQ2和RYR2平均荧光强度降低,蛋白表达降低,结果有统计学意义(P0.05)。通过qRT-PCR检测3组中CASQ2和RYR2基因的mRNA水平表达量,结果显示:H组和H+V组与N组相比,CASQ2和RYR2 mRNA相对表达量明显降低,结果有统计学意义(P0.05);H组与H+V组相比,CASQ2和RYR2的mRNA表达量无明显差异,结果无统计学意义(P0.05)。采用Western blot法检测发现,与N组相比,H组和H+V组中CASQ2和RYR2蛋白表达量降低,结果有统计学意义(P0.05);H+V组与H组相比,CASQ2和RYR2蛋白表达量降低,结果有统计学意义(P0.05)。结论:二乙酰吗啡可致原代大鼠乳鼠心肌细胞形态发生改变,自发性搏动频率及节律发生改变,电生理功能发生改变。维拉帕米对二乙酰吗啡引起的原代心肌细胞自发性搏动频率减少有一定的改善作用。CASQ2和RYR2基因与二乙酰吗啡引起的原代大鼠乳鼠心肌细胞动作电位改变及钙离子通道异常相关。
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.7
【图文】：

新疆医科大学硕士学位论文结 果1 原代大鼠乳鼠心肌细胞培养纯度鉴定培养至第 7d 的原代心肌细胞经激光共聚焦显微镜检测鉴定：原代心肌细胞中可检测到 -Actin 表达，细胞质内 FITC 标记山羊抗小鼠 IgG 抗体与心肌细胞特异蛋白 -Actin 一抗结合，经 488nm 激光激发出现网格状或丝状绿色荧光（图 1.b），DAPI染料与细胞核结合，经紫外光激光激发后出现圆形或椭圆形的蓝色荧光（图 1.a），合成结果可见原代心肌细胞完整形态结构，原代心肌细胞呈多种形态，有三角形、梭形、多边形等，细胞内肌动蛋白呈丝状分布，交织成网络（图 1.c）。每个培养皿内随机取 5 个视野，同时表达蓝色荧光和绿色荧光的细胞为阳性细胞，表达蓝色荧光的数量记为细胞总数，计算阳性细胞所占比例，结果显示原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞纯度＞97%，可以用于后续实验。

改变数量增多。采用细胞形态及搏动状态改变明显的 10-4mol/L 二乙酰吗啡浓度进行后续检测，即为后续试验 H 组，10-4mol/L 二乙酰吗啡和维拉帕米干预组为后续试验 H+V 组。采用 Dunnett-t 检验法用统计软件进行统计学分析得出：与正常对照组相比，二乙酰吗啡组自发性搏动频率降低，P=0.000，说明二乙酰吗啡对心肌细胞自发性搏动频率有影响；与二乙酰吗啡组相比，二乙酰吗啡+维拉帕米组自发性搏动频率升高，P=0.02（表 5），说明维拉帕米对此过程有一定的保护作用。a) b) c)

同浓度二乙酰吗啡干预心肌细胞 24 小时细胞形态改(0, 10-5mol/L, 10-4mol/L, 10-3mol/L, 10-2mol/L)作用心数据三次独立重复试验(均数±标准差)，*P< 0.05。es of cardiomyocytes with morphological changes undne. Cardiomyocytes were switched to ium containing , 10-5mol/L, 10-4mol/L, 10-3mol/L, 10-2mol/L) in 24 hou Means±SEM of three independent experiments, *P< 表 5 不同分组中心肌细胞自发性搏动频率( x s, n=1ous beating frequency of cardiomyocytes in different g频率(次) P 值129.86 7.6989.57 20.63 0.000*组 103.93 14.28 0.02#比，*P＜0.05；与二乙酰吗啡组相比，#P＜0.05。

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本文编号：2786597