低强度脉冲超声治疗再生障碍性贫血模型兔的有效性及机制研究

发布时间：2020-08-10 19:41

【摘要】：目的再生障碍性贫血(Aplastic anemia,AA)简称再障,是由多种病因导致的骨髓衰竭性疾病,表现为骨髓增生低下、全血细胞减少,临床以贫血、出血和感染为主要表现。目前,AA的发病原因尚不明确,可能与物理射线、化学药物、病毒及遗传因素有关。AA的发病机制复杂,主要涉及造血干/祖细胞缺陷、免疫异常和造血微环境的破坏。AA的发病率呈双峰分布曲线,其中一个峰值出现在15~25岁之间,第二个峰值出现在60岁以上,男女发病率无明显差别。临床治疗主要有造血干细胞移植治疗和免疫抑制治疗两种方法,但二者均具有其缺点和局限性。因此,寻找更为安全有效的治疗方法仍是目前研究的热点。低强度脉冲超声(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是以空化效应和机械效应为主的一种超声波。前期实验表明LIPUS治疗显著促进化疗所致骨髓抑制动物骨髓有核细胞增殖,增加外周血白细胞、免疫球蛋白数量,降低腹泻率和死亡率;并且LIPUS通过降低CD34阳性细胞表面黏附分子的表达,促进造血细胞向外周血的迁移;通过降低PU.1的表达,促进HSCs向粒细胞和淋巴细胞的分化。本研究旨在构建苯和环磷酰胺所致的新西兰兔AA动物模型,探索LIPUS治疗AA的有效性及作用机制。方法1.采用苯和环磷酰胺联合建立AA动物模型:苯1.0 ml/kg,注射8次,环磷酰胺15 mg/kg,注射3次,这为一个给药周期,共给药3个周期。建立骨髓增生减低、三系血细胞减少的新西兰兔AA模型。2.16只AA模型兔随机分为对照组和LIPUS组,每组8只。LIPUS组每日于一侧股骨干骺端进行1次超声辐照(0.2 W/cm~2,0.6 MHz,20min),持续30天。对照组接受假辐照。观察新西兰兔的一般情况,血常规检测外周血血细胞计数,骨髓组织病理切片观察骨髓增殖情况,ELISA检测外周血免疫相关分子的变化。3.细胞实验分为4组,BMSC组:BMSCs单独培养;BMSC+Th17组:首先将BMSCs接种于六孔板,待其铺满后加入Th17细胞;BMSC+Th17+LIPUS组:首先将BMSCs接种于六孔板,待其铺满后加入Th17细胞,共培养的细胞过夜后进行1次LIPUS辐照(30mW/cm~2,0.6 MHz,20min);Th17组:Th17细胞单独培养。四组细胞同时进行种板及样本收集。ELISA检测培养液上清中IL-6、IL-17A和IL-17F的水平;RT-PCR及WB检测Th17细胞STAT3的表达水平。结果1.32只新西兰兔给药前WBCs、RBCs、PLTs和HGB计数分别为:15.13±5.12×10~9/L、8.82±0.58×10~(12)/L、234±107×10~9/L和311±20g/L,给药结束后分别为:5.55±5.55×10~9/L、7.06±0.54×10~(12)/L、167±35×10~9/L和251±14g/L。模型兔WBCs、RBCs、PLTs和HGB计数分别下降63.3%、20.0%、28.6%和19.3%,且与正常兔相比差异均有统计学意义(P0.05)。正常新西兰兔骨髓造血组织丰富,细胞增殖活跃;模型兔骨髓组织的正常结构被破坏,造血组织减少,脂肪组织增加,骨髓小粒空虚,造血细胞减少。2.模型兔出现活动减少、反应迟钝、食物和水摄入量减少、脱发等症状,LIPUS辐照后这些症状有所改善。LIPUS组死亡1只(12.5%),对照组死亡2只(25%),两组死亡率无统计学差异(P0.05)。实验第151天时:LIPUS组WBCs、RBCs、PLTs和HGB计数分别是11.53±6.38×10~9/L、10.12±0.83×10~(12)/L、239±32×10~9/L和253±11g/L;对照组WBCs、RBCs、PLTs和HGB计数分别是9.23±3.70×10~9/L、8.56±0.60×10~(12)/L、149±32×10~9/L和224±13g/L;两组RBCs、PLTs和HGB计数有统计学差异(P0.05)。与实验第93天时相比,实验第123天时,对照组骨髓有核细胞计数无明显改变(P0.05),而LIPUS组则显著升高,甚至超过了正常兔(P0.05)。LIPUS治疗后,血清FOXP3水平升高,IL-17水平却明显下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。LIPUS治疗后,LIPUS组和对照组血清IL-4和IFN-γ水平的变化趋势相同,差异无统计学意义(P0.05)。3.LIPUS辐照后0.5小时,Th17细胞STAT3蛋白表达水平最低,是LIPUS抑制作用表现最明显的时刻,此时采集标本最佳。WB和PCR检测表明:BMSCs可抑制Th17细胞STAT3基因的表达,并且LIPUS可直接或通过BMSCs间接抑制Th17细胞STAT3基因的表达。ELISA检测表明:Th17细胞可抑制BMSCs分泌IL-6,LIPUS可直接或通过Th17细胞间接抑制BMSCs分泌IL-6。结论1.调整后的给药方法可建立骨髓增生减低、外周血三系细胞减少的新西兰兔AA动物模型。2.LIPUS不仅可升高外周血WBCs、RBCs、PLTs和HGB的数量,促进骨髓有核细胞的增殖,改善骨髓脂肪化的状态;还可以调节外周血免疫分子的水平,纠正免疫分子的异常。3.LIPUS可直接或通过减少BMSCs分泌IL-6间接抑制Th17细胞分泌IL-17,进而改善模型兔FOXP3/IL-17比例失衡状态。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R556.5
【图文】：

造血组织,骨髓组织,箭头,血细胞计数

重庆医科大学博士研究生学位论文表 1.1 32 只正常兔的血细胞计数Tab 1.1 Blood cell count in 32 normal rabbitsItem WBCs (×109/L) RBCs (×1012/L) PLTs (×109/L) HGB(g/L)Average Value 15.13 8.82 234 311Standard Deviation 5.12 0.58 107 2095% Confidence Interval 11.5-17.0 8.46-9.20 178-217 296-3182.1.3 骨髓组织病理切片如图 1.1 所示：正常新西兰兔的骨髓组织结构完整，造血组织丰富，有核细胞增殖活跃。

变化趋势,统计学意义,波动性,持续下降

图 1.2 造模期间新西兰兔白细胞的变化趋势，*与 0 天相比，P < 0.05Fig 1.2 The change trend of WBCs in New Zealand rabbits during the modeling period* compared with 0 days, P< 0.05.2.2 红细胞的变化趋势如图 1.3 所示：给药的前 33 天新西兰兔 RBCs 数目持续下降，第 33 天时 R为 7.10±0.91×1012/L，与 0 天相比，下降 19.5%，差异有统计学意义（P < 0.至 43 天出现短暂的升高，随后维持在相对稳定的水平，第 63 天时 RBCs 8.09±0.73×1012/L；63 天之后 RBCs 计数呈波动性下降趋势，93 天时降至最7.06±0.54×1012/L。

变化趋势,统计学意义,持续下降,给药

图 1.3 造模期间新西兰兔红细胞的变化趋势，*与 0 天相比，P < 0.05Fig 1.3 The change trend of RBCs in New Zealand rabbits during the modeling period* compared with 0 days, P< 0.05.2.3 血小板的变化趋势如图 1.4 所示：给药的前 24 天新西兰兔 PLTs 计数持续下降，第 24 天时为 158±31×109/L，与 0 天相比，下降 32.5%，差异有统计学意义（P < 0.033 至 73 天时 PLTs 保持相对稳定；第 73 至 83 天之间 PLTs 计数迅速升高 PLTs 计数为 197±25×109/L，与 0 天相比，差异无统计学意义（P > 0.05 PLTs 计数很快下降，达较低水平 167±35×109/L。

【参考文献】