【摘要】：实验背景冠状动脉性心脏病(coronary artery heart disease,CHD)简称冠心病,是一种由冠状动脉狭窄、供血不足而引起的心肌机能障碍和(或)器质性病变的常见心脏疾病,已成为造成人类死亡的第一大疾病。目前,冠心病的治疗主要有三种方式:药物治疗、外科手术治疗和介入治疗。经皮冠状动脉介入治疗是目前治疗冠状动脉严重狭窄最主要的手段,被广泛的应用于临床。但是由于支架植入时机械性扩张冠状动脉,造成血管壁深层损伤,从而引起炎症反应和血管平滑肌细胞过度增生导致血管内膜增生和血栓形成,所以支架植入人体后3-6个月仍存在13%-18%的再狭窄发生。因此支架内再狭窄(in-stent restenosis,ISR)机制的研究是心血管领域的研究热点之一,具有重大的理论和现实意义。大量的研究发现当医用金属材料长期植入人体内会发生腐蚀或磨蚀现象,这会造成金属离子溶出而影响到人体组织的新陈代谢,而支架中溶出的镍(Ni)离子就是一种众所周知的有害元素。镍离子可引起细胞毒性作用,激活炎症过程,增加炎症细胞因子的产生,包括白细胞介素(IL-1b)、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子(TNF)。另一方面,金属支架能持续释放镍离子,导致血管平滑肌细胞(VSMC)过度增殖,这与ISR有关。有研究表明镍离子诱导再狭窄的原因与血管内皮生长因子(VEGF)有关。因此,研发一种新型可降低ISR发生的低镍冠脉金属支架平台是冠脉支架的一个改进方向。本研究进行了6个月的在体动物实验观察包括评估低镍高氮不锈钢(HNS)支架对内皮化及内膜增生的影响,同时体外实验包括评估人脐静脉内皮细胞(huvecs)的增殖情况和血管内皮细胞的反应,研究低镍高氮不锈钢材料对新生内膜增生的作用机制。本研究希望能为低镍高氮不锈钢支架的临床应用提供科学依据。实验目的本实验采用低镍高氮不锈钢金属支架(high nitrogen low nickel stainless or high nitrogen nickel-free stainless steel,HNS),应用血液相容性和细胞相容性来评价这种新型支架的体外安全性;而后通过在体动物实验,经组织学及影像学方法观察该支架植入健康家猪冠脉后28天和6个月的支架内膜增生的情况,并探讨其应用在临床的可行性;最后通过分子生物学等实验方法观察新型HNS支架材料对人脐静脉内皮细胞增殖的影响并研究了可能的机制。实验方法1.血液相容性检测:以316L不锈钢支架材料为对照组,通过溶血实验、蛋白吸附实验、血小板吸附实验评价新型低镍高氮不锈钢支架的体外血液相容性。2.组织相容性评价:将HUVEC细胞培养在316L不锈钢支架材料和HNS支架材料表面,应用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐比色法(2methyl thiazole diphenyl tetrazolium bromide salt,MTT比色法)对HUVEC细胞活性进行了检测即体外细胞相容性评价。3.在体实验研究:将316L不锈钢支架和HNS支架植入健康家猪冠状动脉,分别于支架植入后28天和6个月应用定量冠脉造影检测血管的狭窄程度和晚期管腔丢失,而后取支架植入段的冠脉进行组织学检测和扫描电镜观察,最后应用Q-PCR方法检测植入支架的血管内皮VEGF-A和b-FGFmRNA的表达。4.离体实验研究:将HUVEC细胞与316L不锈钢金属材料和HNS支架材料共培养,于共培养1天和3天应用ELISA方法检测培养液中HUVEC释放的IL-6含量;于1,3,5天分别应用荧光显微镜观察HUVEC细胞增殖情况;应用western blot方法检测培养7天的HUVEC细胞内p-STAT3,ERK1/2表达。实验结果1.316L不锈钢组及HNS支架组表面的溶血率均5%,两组溶血率比较无差异;与316L不锈钢支架相比,HNS组支架在吸附白蛋白及纤维蛋白方面无统计学差异(P0.05);与316不锈钢组相比,HNS组表面吸附血小板数量明显减少,具有统计学差异(4.18±0.54×10~9/L比5.48±0.89×10~9/L,P0.05)。2.应用MTT法检测细胞活性结果显示:无论是在培养24小时和72小时时,HNS组与316L不锈钢HUVEC细胞活性无统计学差异(P0.05)3.在体实验结果:(1)316L不锈钢支架和HNS支架植入1个月时的造影结果显示HNS支架组在直径狭窄百分比和LLL上未见明显差别(D%:32.3±7.3%比32.2±11.3%,P0.05;LLL:0.99±0.25比0.98±0.34,P0.05),而6个月时的造影结果显示HNS支架组在直径狭窄百分比(35.9±10.2%比53.5±20.8%,P0.05)和LLL(1.08±0.27mm比1.61±0.68mm,P0.05)上均优于316L不锈钢支架组。(2)1个月时无论在大体标本还是通过扫描电镜的观察,HNS组和316L组支架均已被内膜覆盖。(3)测量6个月时对两组支架组织学HE染色的切片结果显示:HNS组管腔面积较316L组大(3.46±1.49mm~2比1.91±1.04mm~2,P0.05),具有统计学差异。在管腔面积狭窄百分比方面HNS组小于316L组(54.0±17.8%比73.6±14.5,P0.05),具有统计学差异。在反映支架周围炎症情况的炎症指数方面,HNS支架组明显优于316L不锈钢组(1.71±0.43比2.68±0.57,P0.05)。(4)在28天及6个月的随访时间点内,HNS组及316L组均无实验动物死亡或发生ST。(5)支架植入28天后,HNS组支架表面覆盖内膜组织VEGF-A mRNA表达与316L组无差异(0.99±0.16比1.08±0.09,P0.05);316L组支架植入6个月后覆盖支架表面的内膜组织表达的VEGF-A mRNA明显高于HNS组(2.86±0.8比1.66±0.22,P0.01);而无论28天或6个月时支架表面覆盖内膜组织的b-FGFmRNA表达,316L组和HNS组之间均无差异(P0.05)。4.离体实验结果:将HUVEC和316L不锈钢材料与HNS支架材料共培养1,3,5天后观察到HNS表面细胞数均少于316L不锈钢组;HUVEC培养一天后316L组(0.31±0.054 pg/ml)释放的IL-6水平明显高于HNS组(0.23±0.02pg/ml,P0.01);HUVEC培养3天后316L组(0.35±0.087 pg/ml)释放的IL-6水平也高于HNS组(0.26±0.02 pg/ml,P0.05);Western blot结果显示培养7天后,在HNS支架表面生长的HUVECs中p-STAT3表达(0.2101±0.005)明显低于在316L组(0.2485±0.006,P0.05);ERK1/2在HNS表面生长的HUVEC中的表达(0.671±0.016)也是明显低于316L组(0.829±0.054,P0.05)。实验结论新型低镍高氮不锈钢冠脉支架具有良好的体外组织相容性。其可以降低支架术后的内膜增生。其动物实验的安全性(死亡及ST)与316L不锈钢支架一致。新型低镍高氮冠脉支架可能是通过IL-6/STAT3通路抑制内皮细胞VEGF表达而减少支架内膜增生。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R541.4
【图文】：
图 1.1 DES 的基本结构组成4 未来针对 ISR 的冠脉器械发展方向4.1 DES 的改进从 DES 的演变过程我们可以发现，对于 DES 的优化和改进主要是优化药物的动力学、改进药物的载体和金属平台（见表 4），最终减少药物的副作用低血管对异物的不良反应。针对 ISR 的机制，新 代的 DES 对支架三个主要组成部分都进行了改进，到了临床应用的验证，无论从安全性还是疗效均优于前 代 DES。下面我们这三方面对新 代的 DES 进行详细说明：（1）抗增殖药物：理想的抗增殖药物必须满足三个要求：使内皮细胞尽成内皮化的同时还可以抑制新生内膜的增生，具有广泛的治疗窗以及亲脂
图 2.1 不同材料溶血率情况蛋白吸附实验NS 组吸附白蛋白的数量为 15.37±0.48μg/μl，而 316L 组为 1g/μl，两组无统计学差异（P>0.05）。HNS 组吸附纤维蛋白的数量为7μg/μl，而 316L 组为 2.15±0.35μg/μl，两组无统计学差异（P＞ 2.4，图 2.2）。表 2.4 不同材料对蛋白吸附数量的比较白蛋白（μg/μl） 纤维蛋白（μg/μl）不锈钢组 16.58±0.56 2.15±0.35 15.37±0.48 2.08±0.27
图 2.2 不同支架材料吸附蛋白量（μg/μl）2.4.3 血小板吸附实验血小板吸附实验结果显示：HNS组钢板表面吸附血小板数量较316组少（4.1±0.54×109/L 比 5.48±0.89×109/L，P＜0.05）（见表 2.4 和图 2.3）。表 2.4 不同材料对血小板吸附数量的比较名称 316L 组（n=6）HNS 组（n=6）血小板计数（109/L） 5.48±0.89 4.18±0.54*注：与 316L 组比较 *P＜0.05
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