miR-23a参与低氧性肺动脉高压发病机制的研究

发布时间：2020-08-16 19:35

【摘要】：长期慢性缺氧会引起肺动脉高压,增高的肺动脉压力导致右心功能不全。有研究报道,高原型心脏病的发病关键病理生理学机制也在于缺氧性肺动脉高压(HPH)。了解HPH的发病机制是预防和治疗慢性缺氧性肺部疾病导致的右心功能不全和高原型心脏病的关键因素之一。肺动脉高压的主要病理学变化特点是缺氧性肺血管收缩和肺血管结构重建。肥厚的肺动脉平滑肌细胞增殖,细胞外基质合成增加,血管平滑肌中层肥厚,肺血管重塑过程中平滑肌样非血管性细胞的存在可能会导致肺小动脉壁增厚、狭窄内径、肺血管阻力增加,肺动脉压力升高。长期肺动脉高压可能导致右心室代偿性肥大甚至右心衰竭。肺动脉平滑肌细胞的异常增殖、凋亡和迁移是肺血管结构重建中最重要的病理生理学特点。既往研究往往集中在缺氧及缺氧引起的病理生理学变化及相关生物活性分子在调节细胞增殖、凋亡和迁移等功能。最近研究结果显示,低氧能够明显下调肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)收缩表型标记蛋白的表达,然而,这种具体的下调机制还不明确。因此,对PASMCs表型转化的分子机制的深入研究可以帮助我们解释其内在机制,包括在缺氧性肺动脉高压过程中的肺动脉重构的机理。mi RNA是一类具有调节功能的内源性非编码单链RNA。据不完全统计,mi RNA调节着人类三分之一的基因。近年来研究发现miRNA参与调节一些正常生理过程或特定的病理和生理过程。miRNA的作用机制可以从以下两个方面来解释。首先,它通过直接与目标mRNA的3′-UTR非翻译区结合降低mRNA的表达,其次,它通过不完全互补配对和抑制翻译的过程来调节miRNA的表达。几项研究已经表明,miRNAs参与多种生理过程,如细胞分化,新陈代谢,细胞凋亡和增殖。也参与调节许多其它的病理过程,如肿瘤发生,炎症消退和血管增生。第一部分:miR-23a影响缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞表型转化目的:探讨miR-23a在缺氧诱导的肺动脉平滑肌表型转换中的作用及低氧状态下miR-23a的表达机制。方法:胶原酶消化法提取大鼠PASMCs细胞并进行培养。在PASMCs进行缺氧处理(3%o2)后,使用westernblot免疫印迹法检测培养细胞中sm-mhc,smα肌动蛋白,calponin-1,和sm22α蛋白的表达水平。缺氧条件下,使用mir-23amimic转染pasmcs细胞。edu染色法检测细胞增殖活性。结果:1缺氧对大鼠pasmcs细胞的影响一般特点及不同mirna的筛选原代大鼠平滑肌细胞生长在培养瓶中贴壁生长,大部分细胞呈梭形,胞浆丰富,胞质密度高。细胞呈捆状平行排列,pasmcs细胞呈峰谷分布特征。使用sm-α肌动蛋白抗体进行免疫荧光染色后,我们观察到在细胞质中出现明亮的绿色丝状荧光。平均α-肌动蛋白阳性率水平超过95%。与常氧对照组相比,在h24h组中,mir-23a,mir-25,mir-93和mir-106的表达水平明显增高。与常氧(n24h)组相比,mirna表达水平明显增加,其表达水平是常氧组的5.1倍。但mir-143和mir-145表达水平无明显变化。观察缺氧处理48h后mir-23a表达水平发现,结果表明,缺氧48h后(h48h),与常氧组(n48h)相比,mir-23a表达水平升高约3.8倍。2缺氧对大鼠pasmcs收缩表型标志蛋白表达及pasmcs增殖的影响在常氧对照组和缺氧处理组的肺动脉平滑肌细胞(3%o2,24h或48h)中,检测sm-mhc,smα肌动蛋白,calponin-1和sm22α的表达水平。结果表明,sm-mhc,smα肌动蛋白,calponin-1,和sm22α的表达水平在h24h组明显低于正常对照组(p0.05)。缺氧处理48h后,在pasmcs收缩表型标记蛋白明显低于对照组(n48h)。提示,大鼠pasmcs在缺氧刺激下发生表型转化。使用edu染色法观测常氧及3%o2乏氧状态下培养的大鼠原代pasmcs细胞的增殖活性。乏氧处理后,edu染色48h阳性率(h48h)明显低于常氧对照组,表明缺氧处理能显著增强pasmcs的增殖活性。3pasmcs细胞中,mir-23a在缺氧诱导的收缩表型标记蛋白的表达下调的作用与转染空载体mirna的细胞相比,转染mir-23a抑制剂后,收缩蛋白(sm-mhc,sma肌动蛋白,calponin-1,sm22α)表达水平明显上调(p0.05)。在转染mir-23amimic的pasmcs细胞中,检测发现,转染后48h,收缩蛋白标记物表达水平明显下调(p0.05)。4mir-23a在缺氧诱导pasmcs增殖活性增强中的作用缺氧条件下,肺动脉平滑肌细胞edu染色阳性率在vehicle和inhibitorctrl组之间中无显著性差异。在转染mir-23ainhibitor的pasmcs细胞中,转染mir-23a抑制剂后48h,edu染色阳性率明显减低,这一结果表明,mir-23a在促进pasmcs缺氧诱导增殖活性中具有重要的作用。在转染mimic对照组的pasmcs细胞中,edu染色阳性率与空白组相比,二者未见明显统计学差异(p0.05)。转染mir-23amimic48h后,与转染mimic对照组相比,pasmcs细胞edu染色阳性率增加(p0.05)。这一结果表明,常氧条件下过表达mir-23a可诱导pasmcs细胞增殖明显增加。小结:缺氧状态下,pasmcs收缩表型标记蛋白明显降低,表明缺氧处理能显著增强pasmcs的增殖活性。缺氧处理后,mir-23a表达水平升高,并且能够下调收缩表型标记蛋白的水平,说明其在促进pasmcs缺氧诱导增殖活性中具有重要的作用。第二部分:mir-23a在缺氧肺动脉平滑肌细胞中表达上调的作用机制目的:探讨mir-23a在缺氧情况下表达水平上调的调控机制及其病理生理学意义。方法:先在缺氧条件下使用hif-1αsirna及空白对照sirna进行pasmcs细胞转染;转染后连续培养pasmcs细胞48h后,再使用rt-qpcr方法检测pasmcs细胞中mirna的表达水平;使用chip方法来验证hif-1α结合位点;使用双荧光素酶报告基因方法来研究hif-1α及其结合位点的作用。结果:1hif-1α在缺氧诱导的mirna-23a表达上调中的调控作用在缺氧条件下,使用hif-1αsirna转染pasmcs细胞后,mir-23a表达水平明显减低。这一结果表明,缺氧条件下mir-23a表达上调与hif-1α有关。在edhb(500μm)24h(edhb24h)组中,与对照组相比,常氧培养pasmcs细胞hif-1α蛋白水平和mir-23a表达水平明显增高。pri-mir-23a-1,pri-mir-23a-2及pri-mir-23a-3含量的变化反映出mir-23a-1,mir-23a-2,mir-23a-3转录活性增强。当pasmcs在缺氧条件下培养并使用hif-1α特异性sirna转染后,pri-mir-23a-1和pri-mir-23a-3表达水平明显降低,这一结果表明,hif-1α参与mir-23a-1和mir-23a-3转录的激活作用。2检测hif-1α与mir-23a-1和mir-23a-3的上游5kb起始区的结合情况。在pasmcs细胞中,与缺氧处理前(n组)相比,缺氧24h(h24h)和48h(h48h)后,三个调节mir-23a-1非翻译区的上游5kb预测位点(r1,r2,r3)与hif-1α结合力明显增强。在r1中,hif-1α富集程度最高。与常氧对照组(n)相比,缺氧24h组(h24h)和缺氧48h组(h48h)中,mir-23a-3的非翻译区与hif-1α结合明显增强,差异具有统计学意义(p0.05)。3使用chip法检测hif-1α在mir-23a-1和mir-23a-3转录激活中的作用为了进一步阐明缺氧对hif-1α在mir-23a-1和mir-23a-3基因转录活性的影响,使用野生型受体基因载体(wt)或突变(m1,m2,m3)及hif-1α过表达质粒共转染,在缺氧条件下(1%o2浓度)分别转染hek293ft细胞。结果表明,使用m1,m2,m3突变载体转染后,报告基因活性明显下降。转染m3的突变载体报告基因活性水平最低。缺氧可以明显增加野生型luc-mir-23a-1(wt)荧光素酶活性,但对于突变型luc-mir-23a-1m3(m3)的荧光素酶活性无明显影响。此外,野生型和突变型报告基因载体和hif-1α过表达质粒及其对照载体共转染293ft细胞。结果显示,过表达hif-1α可以明显改善野生型luc-mir-23a-1荧光素酶活性(wt)(1.7倍),但对luc-mir-23a-1m3突变组的荧光素酶活性没有明显影响(m3)。低氧条件下,干预hif-1α能够显著削弱野生型luc-mir-23a-1(wt)荧光素酶活性增强作用。对于mir-23a-3,缺氧条件下(1%氧浓度)与hif-1α过表达质粒共转染两种情况,能分别提高野生型luc-mir-23a-3荧光素酶活性(wt)2.8倍和1.8倍,但对luc-mir-23a-3突变没有影响(m)。缺氧条件下干预hif-1α在能够显著削弱野生型luc-mir-23a-3活性(wt)报告基因的活性。这些结果表明,缺氧可以明显上调mir-23a-1和mir-23a-3的表达水平,这是由于hif-1α转录激活发挥作用。小结:缺氧条件下mir-23a表达上调与hif-1α表达水平有关,hif-1α可以参与mir-23a-1和mir-23a-3的转录激活作用。mir-23a在缺氧下表达增加主要是由于mir-23a-1和mir-23a-3上调引起。缺氧可以明显上调mir-23a-1和mir-23a-3的表达水平,这是由于hif-1α转录激活发挥作用。第三部分:慢性缺氧下大鼠肺中小动脉mir-23a表达水平、肺动脉平均压、右心室重量指数及肺动脉形态学的变化目的:构建大鼠肺动脉高压模型,探讨慢性缺氧状态下肺动脉平滑肌细胞mir-23a的表达水平及低氧对大鼠肺动脉平均压,右心室重量指数以及肺小动脉壁,内膜中层厚度的影响。以期在动物模型中进一步阐明慢性缺氧的病理生理学意义。方法:ch组大鼠和常氧下喂养的对照组大鼠(nc组)分别放在模拟海拔5000米的低压氧舱(thermoscientific,waltham,ma)中喂养21天及正常氧压条件下喂养。每组随机选择8只大鼠。每只大鼠腹腔注射10%乌拉坦(1ml/100g),处理后大鼠被固定到一个平台上,分离右侧颈外静脉。每只大鼠静脉注射肝素生理盐水溶液(0.2ml/100g/100g体重)进行全身抗凝。自右心室进行肺动脉插管(0.45mmid和0.8mmod),使用动力实验室多导生理记录仪测量大鼠平均肺动脉压(mpap)。处死大鼠,开胸切除心脏。将心房和结缔组织仔细分离。沿室间隔游离右心室游离壁。用下列公式计算右心室重量指数:右心室重量/(左心室+室间隔)重量。结果:1慢性缺氧对肺动脉平均压(mpap),右心室重量指数及肺小动脉壁、内膜中层厚度的影响。在慢性低氧组(ch)中,肺动脉平均压明显升高(p0.05),比对照组增加约2倍。提示慢性低氧可显著提高肺动脉压。在慢性缺氧组大鼠(ch)中,与常氧对照组(nc)相比,rv/(lv+s)明显增加(p0.05)。提示慢性缺氧可导致大鼠右心室肥厚。我们测量了血管外径和管壁厚度(外径-内径),及内膜中层厚度。结果表明,在常氧对照组大鼠(nc)通常肺动脉壁较薄,管腔较大,外径为81.31±2.8μm,管壁厚度为10.57±2.6μm,内膜中层厚度为3.6±0.8μm(表1)。而在慢性缺氧组(ch)大鼠中,肺小动脉外径为86.61±6.1μm,管壁厚度为21.3±4.4μm,内中膜厚度为8.8±1.6μm。2慢性缺氧状态下肺小动脉miR-23a的表达水平在慢性缺氧组(CH)中,与常氧对照组(NC)相比,肺小动脉mi R-23a表达水平明显增加(P0.05)。小结:慢性缺氧可导致肺小动脉miR-23a表达水平明显增加,并引起大鼠右心室肥厚。慢性缺氧可显著提高肺小动脉壁的厚度,导致管壁内侧平滑肌细胞增殖及肺小动脉重构。结论:缺氧状态下,PASMCs收缩表型标记蛋白明显降低,mi R-23a表达水平升高,并且能够下调收缩表型标记蛋白的水平,说明其在促进PASMCs缺氧诱导增殖活性中具有重要的作用。HIF-1α参与了miRNA-23a表达上调的调控作用。miR-23a参与低氧性肺动脉高压发病机制,有可能成为治疗低氧性肺动脉高压的靶向药物。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1
【图文】：

缺氧对大鼠PASMCs细胞的影响一般特点及不同miRNA的筛选Fig.1EffectofanoxiaonthegeneralcharacteristicsofratPASMCsandscreeningofdifferentiatedmiRNA.

肺动脉平滑肌细胞,表型

图2 miR-23a在低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞收缩表型标记蛋白下调中的作用Fig.2 Role of miR-23a in anoxia-induced downregulation of thecontractile phenotype marker proteins in PASMCs.Note: (A) Detecting the expression of the SM-MHC, SM-α-actin, calponin-1and SM22α proteins with western blot analysis when PASMCs weretransfected with miR-23a inhibitor under anoxia. Compared to the controlgroup, *P<0.05. (B) Detecting the expression of the SM-MHC, SM-α-actin,calponin-1 and SM22α proteins with western blot when PASMCs weretransfected with miR-23a mimic under normoxia，analysis with β-actin as theinternal reference protein. Based on a comparison with the control group,*P<0.05. (C) Detecting the proliferative activity of PASMCs transfected withmiR-23a inhibitor under anoxia by means of EdU staining. (D) Detecting the

表达水平

图 1 HIF-1α在低氧诱导的 miR-23a 表达水平上调中的作用Fig.1 Role of HIF-1α in anoxia-induced upregulation of miR-23a expression.Note：(A) HIF-1α mediated upregulation of miR-23a under anoxia, *P<0.05.(B) EDHB could upregulate the expression of miR-23a in PASMCs undernormoxia, *P<0.05. (C) HIF-1α mediated the upregulation of the expressionof pri-miR-23a-1 and pri-miR-23a-3 under anoxia, *P<0.05. PASMCs,pulmonary artery smooth muscle cells.

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