MicroRNA-145对急性心肌梗死后血管新生的影响及靶向研究

发布时间：2020-08-15 21:57

【摘要】：背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)早期采取及时的再灌注策略能有效恢复缺血心肌的血流,但也会导致心肌微循环不可逆的损伤,其中包括心肌微血管密度的下降。目的探讨micro RNA-145(miR-145)对急性心肌梗死后血管新生的影响及靶向调控机制。方法首先采用miRNA qRT-PCR检测人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)在100μM和200μM CoCl_2诱导的缺氧状态下mi R-145表达变化。再分别用Ed U掺入试验、划痕和Transwell迁移试验、Annexin V/PI染色、小管形成试验检测miR-145在100μM Co Cl_2干预下对内皮细胞增殖、迁移、生存和毛细网状结构形成的影响。miRanda、mirWalk等生物信息学软件预测miR-145的靶基因及与真核细胞翻译起始因子4B(eukaryotic translation initiation factor 4B,eIF4B)3’UTR的结合位点,并用双荧光素酶报告试验验证两者的结合。内皮细胞转染eIF4B siRNA后Wester blot检测eIF4B、c-Myc、Hif1α、Vegfa和抗凋亡因子Bcl2的表达,紧接着转染mi R-145后再检测相关信号蛋白的变化。最后,在AMI模型小鼠体内注射纯化的pre-miR-145干扰及对照腺病毒2周,M型超声心动图评价小鼠心功能,免疫荧光染色检测心肌微血管内皮细胞增殖、凋亡和微血管密度。结果在100μM CoCl_2诱导的缺氧状态下,内皮细胞中miR-145变化不明显,但在200μM CoCl_2时,其含量持续、显著降低(P0.05)。与对照组相比,agomiR-145显著抑制内皮细胞增殖、迁移、生存和毛细网状结构的形成,antagomiR-145则表现为相反的促进效应(P0.05)。生物信息学预测和双荧光素酶实验证实miR-145可靶向结合eIF4B3’UTR(P0.05)。用siRNA干扰eIF4B表达后,内皮细胞中c-Myc、Hif1α、Vegfa和Bcl2蛋白均较对照组明显降低,agomiR-145亦表现为相似的抑制作用,antagomiR-145则促进了它们的表达上调(P0.05)。AMI小鼠体内干扰miR-145表达可促进心肌微血管内皮细胞增殖,增加毛细血管和小动脉密度,改善心脏射血分数等功能指标(P0.05)。结论MiR-145可通过靶向抑制eIF4B及下游的c-Myc/Hif1α信号和抗凋亡因子Bcl2,调节内皮细胞增殖、迁移、生存和血管新生。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.22
【图文】：

变性 95℃ 2sec PC退火 60℃ 20sec 退延伸 70℃ 10sec 延：-Rad CFX Manager 3.1 分析数据，根据溶解曲线和扩增和基因扩增效率。根据 2-△△Ct公式计算各组 miR-145 的标准表达量。统计分析采用双侧不配对 t 检验，P<0. CoCl2干预 HUVECs 不同时间后 miR-145 表达

1.2 200μM CoCl2处理 HUVECs 不同时间后 miR-145 表达变R-145 expressions in HUVECs intervened with 200μM CoCl2foOne-way ANOVA followed by unpaired t-test: * indicated P<0.0 所示，HUVECs 在 200μM CoCl2干预时，与对照组 0d达均发生持续性地明显下调（P 值均<0.01），并在第 2 iR-145 对内皮细胞增殖、迁移、凋亡和影响

取出 ECL 发光试剂，将等体积的 A 液和 B 液避光配成反应液，充分混匀石蜡填平的培养皿中滴加适量反应液，将 PVDF 膜从 TBST 取出用滤纸吸于石蜡表面，继续滴加适量反应液，轻轻摇匀，放入 Bio-Rad ChemiDoc T像系统，调整大小、时间、分辨率等参数以获取理想的目的条带。7）灰度值计算：采用 Bio-Rad Image Lab 软件分析各目的条带和内参的灰度值，计算两者，每个目的蛋白重复统计 3 次，并使用 GraphPad Prism 软件做数据分析。实验结果1 生物信息学预测结合位点

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本文编号：2794713