miR-199a对大鼠心肌细胞自噬的调控研究

发布时间：2020-08-22 05:23

【摘要】：一、背景与目的自噬是一种维持细胞内环境稳态的重要的代谢过程,通过溶酶体降解长寿命蛋白及无功能的细胞器,从而为细胞代谢提供原料,进而促进细胞的存活。在自噬的发生过程中,微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的前体在ATG4的作用下转化为LC3-I,然后再与磷脂酰乙醇胺结合从而形成LC3-II。在哺乳动物中,LC3-I向LC3-II的转化是自噬体形成的关键步骤,从而被作为最常用的检测自噬的方法之一。微小核糖核酸(micro RNA,mi RNA,mi R-)是一种内源性的非编码的核糖核酸分子,能够在转录后水平调节基因的表达。正因为此,micro RNA能够对多数生物学进程起到调控作用,包括增殖、分化、凋亡和自噬等,从而也与包括心血管疾病在内的很多疾病的发生了关联。Mi RNA在心脏中的作用最早是在果蝇中发现的。其后研究者又发现了mi R-208a、mi R-1和mi R-133等在心肌肥厚中的作用。现在越来越多的研究揭示了mi RNA在心肌梗死的病理生理过程中的重要作用。近年来mi RNA和自噬的关系正越来越受到关注。随着首次报道mi R-30a靶向BECN1调控自噬之后,人们发现了很多通过自噬核心通路起作用的mi RNA。在心肌细胞中Xiao等率先发现了mi RNA调控自噬中的作用。其他研究还发现mi R-30a能够靶向Beclin1调节心肌细胞自噬,mi R-325能靶向ARC增强缺血/再灌注损伤下的心肌细胞自噬等等。Mi R-199a主要在心肌细胞中表达,并且已被发现与多种心血管疾病有关。我们在之前报道的研究中也已经发现mi R-199a能够调控心肌肥厚,但mi R-199a与自噬在心血管系统中的关系尚不清楚。我们设计本研究旨在探讨mi R-199a在心肌细胞自噬中的表达情况及其调控作用。我们通过将离体心肌细胞置于无血清的饥饿环境下,诱导心肌细胞发生自噬,检测mi R-199a的表达情况,并进一步对心肌细胞敲低和过表达mi R-199a来探讨自噬活性的变化。我们还进一步探讨了mi R-199a调控饥饿诱导的心肌细胞自噬的潜在的靶基因。二、研究方法(一)乳大鼠心肌细胞分离和培养原代心肌细胞取自新生2天的SD大鼠。75%酒精消毒乳鼠,于无菌环境下取出心脏,置于D-Hanks液中,去除心房保留心室,以眼科剪将心肌组织分成约1mm3大小组织块,并洗净残留的血液。以胶原酶消化后离心去除上清,并采用梯度贴壁法去除成纤维细胞等其他心脏细胞,保留悬浮细胞即为心肌细胞。计数,接种于12孔或24孔板中以备使用。细胞培养条件为完全DMEM培养基(DMEM+10%胎牛血清+1%青链霉素)。以平衡盐溶液EBSS替代完全DMEM培养基以营造无血清的饥饿环境,一定时间后收取细胞供下一步检测使用。(二)实时定量聚合酶链反应检测(q RT-PCR)以Trizol常规方法抽提乳大鼠心肌细胞的RNA,使用特定的引物进行反转录。实时定量PCR按照SYBR Green Mix的标准步骤执行,采用Rotor-Gene RG-3000A机器进行检测分析。选取U6作为参照物并计算ΔCt值。采用2-ΔΔCt法计算目标核糖核酸的表达水平。引物序列如下所示(5’端至3’端,以下均为大鼠):mi R-199a-3p Forward,CTGAGTACAGTAGTCTGCACAT;mi R-199a-5p Forward,CTGAGTCCCAGTGTTCAGACT;mi RNAs common Reverse,GTGCAGGGTCCGAGGT;Twist1 Forward,CACGCTGCCCTCGGACAA;Twist1 Reverse,GGGACGCGGACATGGACC;U6Forward,CTCGCTTCGGCAGCACA,U6 Reserve,AACGCTTCACGAATTTGCGT。(三)腺病毒构建及细胞转染重组腺病毒的构建、扩增及滴度测定方法按照Graham等提出的经典方法实施。所有DNA均通过腺病毒转染入心肌细胞中。mi R-199a-3p和mi R-199a-5p抑制剂(inhibitor)则通过Lipofectamine LTX转染进心肌细胞。秀丽隐杆线虫的mi RNA inhibitor按照同样的方法设计,并作为阴性对照(NC)。采用q RT-PCR检测转染效率。(四)蛋白免疫印迹检测(Western blot)采用蛋白免疫印迹检测心肌细胞中LC3-I、LC3-II、HSPA5和GAPDH的水平。心肌细胞经饥饿处理后,使用SDS-PAGE Loading Buffer提取蛋白。根据目标蛋白的分子量采用10%或15%的分离胶。常规80-120V电泳,100V、2 h湿转法转膜。5%脱脂牛奶封闭后,孵育一抗4℃过夜。TBST洗涤3次后,室温下避光孵育二抗1 h。采用Odyssey红外激光扫描成像系统检测分析蛋白条带。一抗浓度分别为:anti-LC3(1:500)、anti-GAPDH(1:1000)、anti-HSPA5(1:1000)。二抗浓度:anti-mouse(1:5000),anti-rabbit(1:10000)。(五)细胞免疫荧光检测心肌细胞接种于24孔培养板后,如前所述使用EBSS饥饿处理4h。随后用4%多聚甲醛/PBS室温下固定10 min,1:1000的Triton X-100/PBS作可渗透化处理,5%山羊血清封闭30 min,与anti-LC3抗体(1:200)室温下孵育1 h,PBS洗涤3次后,加入结合Alexa Fluor 594的二抗(1:200)孵育30 min,之后以DAPI染核。甘油封片,放置于Leica TCS SP5激光扫描共聚焦显微镜下观察拍照。镜下观察到的LC3红色荧光小点视为细胞内的自噬体和自噬溶酶体。(六)透射电子显微镜观察心肌细胞经饥饿处理后使用多聚甲醛固定后送检。东芝H7650型透射电子显微镜检测方法按照标准方法操作。透射电镜下观察到双层膜结构囊泡状的自噬体作为自噬定性和定量检测的“金标准”之一。(七)双荧光素酶报告基因融合了Hspa5 m RNA 3’UTR的荧光素酶质粒和mi R-199a类似物被共转染至293T细胞中。转染24 h后裂解细胞。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光酶活性。萤火虫荧光素的活性使用海肾荧光素活性进行标准化,并对结果进行分析。(八)统计学分析计量资料以平均数±标准差表示,每组实验数据至少重复3次。两组间比较采用两独立样本的t检验。以P0.05作为显著性差异标准。三、结果(一)饥饿诱导心肌细胞自噬使用EBSS饥饿4 h后心肌细胞显著发生自噬。Western blot示饥饿组LC3-II/I的比值较对照组显著升高。免疫荧光检测观察到心肌细胞内的LC3红色荧光小点在饥饿组多于对照组。我们采用透射电子显微镜同样观察到了在饥饿条件下心肌细胞内双层膜结构自噬体的形成,而在对照组未能观察到这一现象。上述结果均证实在饥饿4 h后心肌细胞的自噬被显著激活。(二)Twist1和mi R-199a的表达变化由于mi R-199a已被证实与很多心血管疾病有关,因此我们检测了饥饿4 h后心肌细胞中mi R-199a的表达情况。q RT-PCR结果示在饥饿4 h后,心肌细胞中mi R-199a-3p和mi R-199a-5p的表达量均显著降低。为了进一步分析mi R-199a表达降低的机制,我们检测了转录因子Twist1的表达水平。结果显示Twist1在饥饿组的表达同样受到了抑制。由于Twist1作为转录因子,能够调控编码mi R-199a的RNA的表达,因此可以认为在饥饿4 h时,Twist1的表达下降进一步导致了mi R-199a的下调,同时二者都可能与饥饿诱导的心肌细胞自噬有关。(三)过表达mi R-199a抑制饥饿诱导的心肌细胞自噬我们采用过表达mi R-199a的方法来探讨其在饥饿诱导的心肌细胞自噬中的作用。我们首先用mi R-199a过表达腺病毒转染心肌细胞,转染48 h后验证mi R-199a的表达确定转染效率,q RT-PCR结果显示mi R-199a-3p和mi R-199a-5p的表达量均较GFP对照组显著升高12-20倍,提示转染有效。继续用EBSS诱导自噬,Western blot检测结果显示mi R-199a过表达后LC3-II/I的比值显著下降约52%,免疫荧光也观察到mi R-199a过表达后心肌细胞内红色LC3小点的数量较对照组要少。上述结果提示过表达mi R-199a抑制了饥饿诱导的心肌细胞自噬。(四)抑制mi R-199a促进饥饿诱导的心肌细胞自噬使用mi R-199a-3p抑制物(inhibitor)和mi R-199a-5p inhibitor分别处理心肌细胞。Western blot显示抑制mi R-199a-3p和mi R-199a-5p的表达均能显著升高LC3-II/I的比值,且以抑制mi R-199a-5p的作用更为显著。免疫荧光检测同样发现,在抑制mi R-199a-3p和mi R-199a-5p后心肌细胞内的红色LC3小点均较对照组增多,且在mi R-199a-5p组效果更明显。因此上述结果进一步提示下调mi R-199a-3p或mi R-199a-5p的表达水平均能够促进饥饿诱导的心肌细胞自噬活性,而mi R-199a-5p在其中的作用可能更加显著和重要。(五)mi R-199a直接抑制HSPA5表达我们采用生物信息学检索预测mi R-199a可能的靶基因,从而进一步探讨mi R-199a调控心肌细胞自噬的潜在机制。采用mi RBase和Target Scan软件筛选发现热休克蛋白5基因(Hspa5)是mi R-199a的潜在的靶基因。Hspa5编码HSPA5蛋白,又称GRP78,是内质网应激相关标志物,在内质网应激诱导的自噬中起到重要作用。通过生物信息学检索,我们发现Hspa5的3’UTR含有mi R-199a-5p的可能的结合位点,因此我们采用荧光素酶报告基因验证Hspa5是否是mi R-199a的靶基因。结果显示过表达mi R-199a显著抑制了融合有Hspa5-3’-UTR的荧光素酶表达,表明Hspa5是mi R-199a的直接靶基因。Western blot也进一步验证了在过表达mi R-199a后HSPA5蛋白的表达显著受到抑制,而敲低mi R-199a-3p和mi R-199a-5p后都能促进HSPA5蛋白的表达,尤其在敲低mi R-199a-5p后作用更明显。上述结果均提示mi R-199a可能通过靶向Hspa5对心肌细胞自噬起调控作用。四、结论(一)以EBSS平衡盐溶液体外处理心肌细胞营造饥饿环境能够诱导离体的乳大鼠心肌细胞发生自噬,在饥饿4 h后自噬活性被显著激活。(二)在饥饿诱导的自噬时,心肌细胞中mi R-199a的表达显著下降,这可能是通过转录因子Twist1的下调实现的。(三)过表达mi R-199a能显著抑制饥饿诱导的心肌细胞自噬,而敲低mi R-199a-3p和mi R-199a-5p后则能促进自噬的激活,而且以mi R-199a-5p的作用更显著。(四)mi R-199a靶向作用于Hspa5并直接抑制HSPA5的表达,并可能通过这条途径抑制了饥饿诱导的心肌细胞自噬。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54


本文编号：2800315