【摘要】：研究背景及目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是临床常见疾病,是心脑血管疾病的主要病理基础。AS是一种主要发生于大中动脉的慢性炎症性疾病。由于脂质代谢异常,导致血浆脂蛋白浓度升高。在一些理化因素及多种炎症因子刺激下,血管内皮首先发生破损,进而血浆脂质、炎症因子等成分进入动脉内膜并沉积在内膜下间隙。由于血管内皮受损,血流中的单核细胞易与受损的内皮细胞(Endothelial Cell,EC)发生粘附,并通过内皮细胞受损区域进入内皮下。此时,单核细胞摄取内皮下沉积的脂质而转化成巨噬细胞,而后者又可以通过其细胞膜上的清道夫受体摄入大量脂质而形成泡沫细胞。在动脉粥样硬化发展过程中,内皮细胞功能失调是AS发生的始动环节,进一步的发展是血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)受到斑块局部产生的生长因子、细胞因子以及沉积脂质的影响开始增殖,并向内膜方向迁移,并逐渐在内膜下间隙堆积,形成早期的斑块。这些泡沫细胞、增殖的平滑肌细胞、沉积的脂质等共同构成了斑块中的坏死中心,从而导致动脉粥样硬化的形成。在斑块局部产生的大量细胞因子中,血小板衍生因子(Platelet derived growth factor,PDGF)就是其中之一。它的化学趋化性较强,靶细胞主要是血管平滑肌细胞。正常情况下,在血管细胞不表达。当血管受损深达中膜时,其被大量分泌并释放入血,再与受体结合形成二聚体,进而激活下游PI3K/AKT、MAPK等信号通路,促进平滑肌细胞的增殖以及由中层向内膜层的迁移。PDGF有PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD五种亚型,其中PDGF-BB属于最强的体外趋化剂。所以本研究以PDGF-BB作为诱导剂。2006年人类基因组计划完成,大批新基因诞生。2008年国家人类基因组北方研究中心对人类基因组数据库进行生物信息学分析,筛选出许多新基因,人跨膜蛋白98(Transmembrane protein 98,TMEM98)就是其中之一。有研究发现TMEM98与癌症、免疫、炎症发生、发展密切相关。然而,关于TMEM98在心血管领域的研究尚未见报道。本课题组前期研究显示TMEM98不仅在AS小鼠血清及动脉粥样斑块组织中高表达,而且可通过IL-8诱导血管平滑肌细胞的增殖和迁移。本研究旨在进一步探讨TMEM98在PDGF诱导的血管内皮细胞黏附和平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及分子机制,为深入研究AS发病机制提供理论和实验基础。实验方法:(1)运用ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)和实时定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)以及免疫荧光(immunofluorescence)的方法,检测在PDGF-BB刺激下ECs和VSMCs分泌至培养液中TMEM98的含量以及细胞中TMEM98表达量的变化;(2)设计并构建TMEM98的重组质粒和小干扰RNA(Small interference RNA,siTMEM98),分别利用瞬时转染的方法将TMEM98在VSMCs和ECs中进行过表达和敲低(siTMEM98);(3)应用细胞粘附实验检测siTMEM98对单核-内皮细胞粘附的影响;(4)Boyden Chamber方法检测TMEM98对VSMCs迁移的影响;(5)用MTT和CCK-8检测TMEM98对VSMCs细胞增殖的影响;(6)通过免疫荧光技术分析TMEM98对VSMCs细胞伪足形成的影响;(7)通过qPCR的方法检测siTMEM98对内皮细胞粘附分子ICAM-1(Intercellular adhesion molecule,ICAM-1)和VCAM-1(Vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)表达的影响;(8)运用Western blot法检测TMEM98对AKT/GSK-3β/Cyclin D1信号通路以及β-catenin分子的影响。结果:1.PDGF诱导TMEM98的分泌和表达分别采用PDGF-BB诱导大鼠主动脉平滑肌细胞(Rat aortic smooth muscle cells,A7r5)、人主动脉血管平滑肌细胞(Human aortic smooth muscle cells,AOSMC)和人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),利用ELISA方法检测细胞培养液,发现TMEM98含量明显升高,且具有时间依赖性。qPCR结果也显示上述三种细胞系中TMEM98的表达量明显升高。免疫荧光结果显示PDGF-BB刺激细胞12h,AOSMC和HUVEC中TMEM98的表达量较对照组明显升高。2.TMEM98调节内皮细胞的粘附及分子机制在PDGF-BB诱导下瞬时转染siTMEM98至HUVEC,下调TMEM98可以抑制单核-内皮细胞粘附,过表达TMEM98可以促进单核-内皮细胞粘附。qPCR结果显示瞬时转染siTMEM98至HUVEC中,可以明显抑制粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达。3.TMEM98调节平滑肌细胞的增殖和迁移利用MTT和CCK8检测PDGF-BB诱导的AOSMC和A7r5的增殖,发现siTMEM98可以明显抑制细胞的增殖,而TMEM98过表达可以明显促进其增殖。同样,利用Boyden Chamber检测A7r5和AOSMC的迁移能力,发现siTMEM98可以抑制A7r5和AOSMC的迁移。当外源性TMEM98加入细胞培养液时,研究发现TMEM98也可诱导AOSMC的增殖及迁移,且具有时间和浓度依赖性。免疫荧光结果显示外源性TMEM98可以促进细胞伪足的形成。4.TMEM98通过AKT/GSK-3β/Cyclin D1信号通路及β-catenin分子调节平滑肌细胞增殖和迁移分别利用大鼠原代血管平滑肌细胞、AOSMC和A7r5探寻PDGF诱导的TMEM98对细胞增殖和迁移的分子机制。结果显示siTMEM98可抑制A7r5细胞中p-AKT(T308)、p-AKT(S473)和p-GSK-3β的表达。同样,siTMEM98可抑制PDGF-BB诱导的A7r5细胞中细胞周期蛋白(Cyclin D1)和β-catenin分子的表达。AKT的激动剂(SC79)可以部分恢复siTMEM98下调的大鼠原代血管平滑肌细胞和AOSMC的增殖以及AOSMC的迁移。SC79可以增加GSK-3β的磷酸化和Cyclin D1的表达。AKT通路的抑制剂(BEZ235)可以抑制AOSMC的增殖及迁移,也可抑制GSK-3β的磷酸化和Cyclin D1的表达。结论:1.PDGF-BB可诱导TMEM98的分泌和表达,证明TMEM98是一种分泌蛋白;2.TMEM98可通过ICAM-1和VCAM-1的表达调节单核细胞与内皮细胞的粘附;3.TMEM98促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移;4.TMEM98通过调节Cyclin D1和β-catenin的表达促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移;5.TMEM98通过调控AKT/GSK-3β/Cyclin D1信号通路促进血管平滑肌细胞增殖和迁移。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5
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