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糖基化修饰在HERG-A561V突变通道蛋白折叠及转运异常中作用机制的研究

发布时间:2020-08-25 10:18
【摘要】:背景与目的:先天性长QT综合征(congenital long QT syndrome,cLQTs)是研究室性心律失常及心源性猝死重要的疾病研究模型。HERG基因突变导致2型长QT综合征,是致青少年猝死的重要原因。HERG-A561 V突变导致2型长QT综合征的主要原因是蛋白转运障碍,突变蛋白无法进行正确折叠,从而被滞留于内质网,最终导致细胞膜上成熟且功能完备的HERG通道数量减少。研究表明蛋白质量控制系统及蛋白质糖基化在突变蛋白的折叠过程中发挥重要作用,但其具体机制尚未完全明确。本课题旨在研究葡萄糖苷酶Ⅱβ(GlucosidaseⅡβ)和糖蛋白葡萄糖基转移酶1(UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase 1,UGGT1)是否在HERG-A561V突变蛋白的转运异常过程中起作用,及改变葡萄糖苷酶Ⅱβ的表达是否可以恢复突变蛋白转运及在一定程度上改善HERG通道的功能,从而为LQTS及SCD寻求新的治疗思路。方法:在HEK293细胞瞬时转染pcDNA3-HERG、pcDNA3-HERG/pcDNA3-HERG-A561V、pcDNA3-HERG-A561V以分别构建野生、杂合和突变组细胞。免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光分别检测各组间GlucosidaseⅡβ和UGGT1表达、与HERG蛋白结合及定位的情况;免疫印迹检测调节葡萄糖苷酶Ⅱβ表达前后HERG蛋白表达的变化情况;全细胞膜片钳技术检测在上调葡萄糖苷酶Ⅱβ表达后HERG基因编码的Ikr电流的变化情况。结果:WB检测发现UGGT1和Glucosidase Ⅱβ在杂合、突变组细胞中的表达较之野生组增加。免疫荧光检测发现在HEK293细胞中HERG与UGGT1、GlucosidaseⅡβ之间的作用发生于内质网。免疫共沉淀检测发现UGGT1和GlucosidaseⅡβ在杂合、突变组细胞中与未成熟蛋白的结合比野生组增强。WB结果表明上调葡萄糖苷酶Ⅱβ的表达有利于促进杂合组细胞HERG-A561V蛋白的成熟,而下调的葡萄糖苷酶Ⅱβ则会抑制HERG-A561V蛋白的成熟和转运。全细胞膜片钳检测发现在杂合组细胞中,电流密度在上调葡萄糖苷酶Ⅱβ的表达后增大,激活电流及尾电流的电流幅度分别增加55%和81%结论:本研究发现糖基化及其相关酶类GlucosidaseⅡβ/UGGT1对HERG-A561V突变所致的蛋白转运及成熟障碍有重要的调节作用,该作用在内质网发生,且是由GlucosidaseⅡβ/UGGT1直接与未成熟的HERG蛋白相结合产生,而且上调GlucosidaseⅡβ可以在一定程度上恢复HERG通道蛋白的转运和功能,这为临床上治疗LQTS及其他蛋白转运障碍所致疾病提供了新的可能性。
【学位授予单位】:宁波大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R541.7

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本文编号:2803580

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