巨噬细胞源性MMP9在动脉硬化模型中的相关机制研究

发布时间：2020-08-25 05:21

【摘要】：目的:本研究通过制备清道夫受体启动子连接兔基质金属蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase 9 MMP9)的结构基因,应用原核显微注射技术来制作巨噬细胞特异性表达MMP9的转基因家兔模型来研究动脉粥样硬化疾病的发生。通过体内实验分析巨噬细胞由来的MMP9在动脉硬化斑块形成及发展病理过程中的作用。体外实验观察在MMP9过表达的HepG2细胞内,前蛋白转化酶枯草溶菌素 9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9),低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein Receptor,LDLR)基因表达的变化水平,揭示MMP9,PCSK9和LDLR三者之间的相互作用关系以及它们对脂质代谢的影响。方法:本研究将日本大耳白兔的MMP9 cDNA导入含有清道夫受体启动子的pAL-1载体内,并在结构两端安插绝缘子,使其不受插入染色体位置的影响,在动物体内得到稳定的巨噬细胞特异性MMP9的高表达。将构建好的MMP9基因直接注射到受精卵的雄原核内,然后将带有MMP9基因的受精卵移植到同品系假孕受体雌兔的输卵管中,获得新生转基因仔兔,筛选子一代中转基因雄兔作为精子供体兔,用于繁殖。新生转基因家兔满4个月后全日对其提供0.3%胆固醇添加饲料,持续16周,后将其大动脉及心脏全部分离摘出后用10%中性福尔马林固定,采用HE染色观察大动脉和冠状动脉病理学变化及分子与蛋白水平变化。体外实验采用带有MMP9基因的慢病毒包装质粒转染HepG2细胞,建立MMP9过表达稳转细胞系。实验分组设置对照组、实验组。根据细胞中MMP9基因的荧光表达情况,选择最适转染病毒浓度。RT-PCR,Western Blot进一步验证MMP9 mRNA表达水平和蛋白表达水平。嘌呤霉素5μg/μL浓度筛选2周,保种成功传代的细胞。造模成功后,检测过表达MMP9的HepG2细胞中PCSK9、LDLR在蛋白水平和mRNA水平的表达情况。结果:通过比较高胆固醇负荷饮食喂养的转基因家兔与非转基因家兔,血中低密度脂蛋白,甘油三酯和高密度脂蛋白无显著差异,同时主动脉处动脉硬化斑块面积及位置也无明显差异,进一步病理学分析发现转基因组家兔内膜病变处出现大量钙盐沉积,并伴随不稳定斑块形成。免疫组化染色病理分析动脉病变内部观察到,与非转基因家兔相比,转基因家兔内膜聚集更多富集脂质的泡沫细胞。对冠状动脉分析结果显示,相比较非转基因家兔,转基因家兔冠状动脉斑块表现出与主动脉类似的结果,富集更多巨噬细胞以及出现钙盐沉积。同时发现在转基因家兔主动脉弓部MMP-2,MMP-12以及TIMP-1和TIMP-2蛋白表达增多。体外实验结果显示,带有MMP9基因的慢病毒包装质粒成功转染HepG2细胞,建立了 MMP9过表达的稳转细胞系。MMP9基因过表达后,PCSK9在蛋白水平和mRNA水平均呈现下调趋势。而LDLR在mRNA水平呈现上调趋势,LDLR蛋白水平未出现显著的统计学差异。结论:动脉粥样硬化的发生与MMP9过表达密切相关。一方面,巨噬细胞源性的MMP9增多促进了动脉粥样硬化进展期病变的形成,同时促进了血管钙化的发生;另一方面,细胞过表达MMP9基因,下调了 PCSK9基因水平进而影响LDLR表达水平,并可能影响脂质代谢进程。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5
【图文】：

图－２逦１６周兔子体重变化趋势图逡逑３．３血浆脂质水平监测逡逑转基因家兔满４个月后全日对其提供０．３％胆固醇添加饲料，持续１６周，用同胎的转基因家兔作为对照组。此期间采用血浆脂质分析试剂盒，每周对血浆脂质的变化进行定：总胆固醇（ＴＣ邋），甘油三酯（ＴＧ邋），高密度脂蛋白胆固醇（ＨＤＬ－Ｃ邋）。分析结果发现基因家兔和非转基因家兔在高胆固醇血症方面没有显著差异（图３）。说明了邋ＭＭＰ９转基家兔和非转基因家兔在高胆固醇饮食喂养１６周后，血浆脂质水平变化无显著差异。逡逑雄性逡逑２４００逦ＴＣ｛ｍｇ／ｄＬ）逦ｉｓｏｏ逦ＴＣ邋（ｍｇ／ｄＬ）逡逑＾邋ｊ逦／逡逑…

进行病理学分析可以发现：早期的动脉粥样硬化病变主要集中在主动脉弓部，Ｉｍａｇｅ邋Ｊ软件逡逑计算病变面积得出：转基因家兔和非转基因家兔总体的病变面积在统计学上没有明显差异逡逑（图４），结果表明了邋ＭＭＰ９表达在动脉硬化斑块形成早期可能影响较小。逡逑雌性逡逑—４邋［□转基因…逦ＪＬ逡逑｜３邋－逦［□栜基因网邋＾逡逑ＢＢＩｈ逦Ｉ２邋■邋ｒｎ邋Ｉ逡逑＿

本文编号：2803316