THO复合物在血管平滑肌细胞表型转换中的转录后调控作用研究

发布时间：2020-08-25 03:30

【摘要】：研究背景与目的:THO复合物包括THOC1、THOC2、THOC3、THOC5、THOC6、THOC7,与构成TREX复合体的其他蛋白相互作用,参与mRNA转录和输出,在转录延伸、核RNA输出和基因组稳定中起着重要的调控作用。THOC5通过与CPSF100形成复合体,锚定到THOC5的靶基因上参与RNA 3'末端加工,从而促进立早基因(IEGs)包括Id1,d3和Wnt11(参与调控细胞分化和增殖)等表达,影响细胞的增殖与分化。研究证实,小鼠成纤维细胞和骨髓巨噬细胞THOC5的缺失分别引起143、99个基因下调,这些基因大多是与细胞增殖分化相关的生长因子和细胞因子。在ESC细胞中,THOC5、THOC2缺失导致541个基因下调,提示THOC5的表达水平和原始细胞状态以及细胞增殖分化密切相关。VSMC不同于心肌和骨骼肌,在受到刺激时可以发生表型转换,去分化为合成表型,合成并分泌细胞因子和基质,增殖、迁移至内膜引起病理改变,促进血管疾病的发生与发展。当前对表型转换的机制研究主要集中在转录水平和PI3K/ERK等信号通路上。最新的研究已经开始揭示转录后调控在表型转换中有着重要作用。了解与阐明血管疾病发展过程中动脉平滑肌细胞表型转换过程中THO复合体的作用尤为重要,THO复合物可以作为一个靶基因的识别工具。本研究旨在探讨研究THO复合物特异性调控平滑肌标志性基因表达的作用机制,期望为血管疾病的发病机制提供新的研究通路和新的治疗方向。研究方法:免疫组织化学染色检测CEA斑块中THO亚基THOC5、THOC2表达,进一步通过定量RT-PCR和Western blot验证Thoc5、Thoc2表达。定量RT-PCR检测去分化血管平滑肌细胞(VSMC)中Thoc5、Thoc2表达;构建shRNA敲低Thoc5、Thoc2表达,检测平滑肌标志性基因和增殖迁移能力的变化;RNA-seq分析Thoc5敲低后差异基因表达;采用ChIP-seq、放线菌素(Act-D)实验、RIP-seq进行机制研究;体内球囊拉伤模型损伤颈动脉局部和体外血管外膜成纤维细胞中高表达THOC5,采用定量RT-PCR、IHC、IF检测平滑肌标志性基因的变化。研究结果:免疫组织化学染色检测CEA斑块中THO亚基THOC5、THOC2表达水平显著降低,定量RT-PCR和Western blot水平得到进一步验证。定量RT-PCR检测发现去分化VSMC中Thoc5、Thoc2 mRNA表达水平也显著降低;构建shRNA敲低Thoc5、Thoc2表达,VSMC标志性基因mRNA表达水平显著降低,增殖和迁移能力显著增加,表明THO亚基表达水平降低促使VSMC发生表型转换;RNA-seq从全基因角度分析显示Thoc5可特异性调控VSMC标志性基因,shThoc5组差异基因表达和PDGF-BB/DD刺激平滑肌后的差异基因表达具有高度相关性;ChIP-seq分析显示THOC5结合的全基因组DNA只有14个微弱的峰;Act-D实验发现敲低Thoc5使得平滑肌标志性基因稳定性下降,半衰期缩短;RIP-seq分析发现THOC5和THOC2优先结合平滑肌标志性基因,对表型转换过程中丢失结合基因mRNA进行GSEA富集分析,结果显示其显著富集在P1代特异性高表达的基因侧;大鼠球囊拉伤模型中损伤颈动脉局部高表达THOC5可以促使平滑肌标志性基因表达水平显著上升,抑制新生内膜增生;血管外膜成纤维细胞中过表达THOC5也可以使平滑肌标志性基因表达水平显著升高,促使血管外膜成纤维细胞转变为肌成纤维细胞。结论:本研究揭示了THO复合物对平滑肌标志性基因的特异性调控作用,与VSMC标志性基因mRNA的动态结合可以作为VSMC表型转换的新型机制,第一次提出THO复合物对平滑肌表型转换的转录后调控,其对平滑肌表型的正向调控作用,提示THOC5可以作为血管疾病的潜在干预节点,为血管疾病的发病机制提供新的研究通路和新的治疗方向。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R329.2
【图文】：

终点事件：在随访期间，冠脉三支病变患者中有１３１２例死亡，其中６６３例患逡逑者为心血管死亡。逡逑图１所示的ＫＭ曲线显示冠脉三支病变患者不同ＢＭＩ组别的全因死亡风险差逡逑异显著。与体重正常患者相比，超重患者的全因死亡风险较低（ＨＲ邋０．８３；邋９５％邋ＣＩ逡逑０．７３－０．９４），轻度肥胖患者全因死亡风险最低（ＨＲ邋０＿７６；邋９５％邋ＣＩ０＿６４－０．９１），体重过逡逑轻患者全因死亡风险最高（ＨＲ邋１．４４；邋９５％邋ＣＩ邋０．８９－１．３１邋）。逡逑将ＢＭＩ作为连续变量（图２）用多项式回归模型分析，表明ＢＭＩ与全因死亡逡逑风险之间呈现Ｕ型趋势。逡逑0逦Ｉ－逡逑ｓ．逡逑ｏ逡逑ｓ．逡逑｜逦ｆ逦￣￣逦ｒ￣逡逑０逦５０逦１ＤＧ逦１５０逡逑逦枿访时间（月）逦逡逑逦逦ｉａ邋５＜ＢＭＩ＜２４邋逦邋２４＜ＢＭＫ２ｅ逡逑逦２８＜ＢＭｉ＾３２逦逦邋ＢＭＫ１８．５逡逑—■邋ＢＭｌ＞３２逦逡逑图１邋ＢＭＩ五组全因死亡的ＫＭ曲线逡逑１０逡逑

０．７３－０．９４），轻度肥胖患者全因死亡风险最低（ＨＲ邋０＿７６；邋９５％邋ＣＩ０＿６４－０．９１），体重过逡逑轻患者全因死亡风险最高（ＨＲ邋１．４４；邋９５％邋ＣＩ邋０．８９－１．３１邋）。逡逑将ＢＭＩ作为连续变量（图２）用多项式回归模型分析，表明ＢＭＩ与全因死亡逡逑风险之间呈现Ｕ型趋势。逡逑0逦Ｉ－逡逑ｓ．逡逑ｏ逡逑ｓ．逡逑｜逦ｆ逦￣￣逦ｒ￣逡逑０逦５０逦１ＤＧ逦１５０逡逑逦枿访时间（月）逦逡逑逦逦ｉａ邋５＜ＢＭＩ＜２４邋逦邋２４＜ＢＭＫ２ｅ逡逑逦２８＜ＢＭｉ＾３２逦逦邋ＢＭＫ１８．５逡逑—■邋ＢＭｌ＞３２逦逡逑图１邋ＢＭＩ五组全因死亡的ＫＭ曲线逡逑１０逡逑

图２邋ＢＭＩ作为连续变量多项式回归模型逡逑ＰＣＩ亚组逡逑图３用ＫＭ曲线显示不同ＢＭＩ水平的生存情况，可以看到五组ＢＭＩ之间并无逡逑显著差异。逡逑在调整了年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟史、饮酒史、冠心病家族史、陈逡逑旧心梗史、Ｓｙｎｔａｘ评分、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＴＧ后，做了不同ＢＭＩ组别全因死亡的逡逑ＣＯＸ回归分析。结果显示相对于体重正常患者，超重和轻度肥胖患者的全因死亡风逡逑险有降低的趋势（ＨＲ邋０．９０；邋９５％邋ＣＩ邋０．７１－１．１２）、（ＨＲ邋０．９０；邋９５％邋ＣＩ邋０．６６－１．２３），重度逡逑肥胖患者的全因死亡风险有增加的趋势（ＨＲ邋１．４５；邋９５％邋ＣＩ邋０．８７－２．４４），但均无统计逡逑学意义，体重较轻患者的全因死亡风险无显著差异（ＨＲ邋０．５９；邋９５％邋ＣＩ邋０．１４－２．３８）（图逡逑４）。逡逑在调整了年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟史、饮酒史、冠心病家族史、陈逡逑旧心梗史、Ｓｙｎｔａｘ评分、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＴＧ后，做了不同ＢＭＩ组别心血管死亡逡逑的ＣＯＸ回归分析，结果显示相对于体重正常患者，超重患者的心血管死亡风险有逡逑降低的趋势但无统计学意义（ＨＲ邋０．８９；邋９５％邋ＣＩ邋０．６３－１．２４）

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本文编号：2803209