【摘要】：目的:脂肪组织是一个活跃的内分泌器官,释放多种具有生物活性的脂肪因子,这些脂肪因子作用于免疫细胞,引起局部和全身炎症反应,直接或间接影响内皮功能和血管健康。内脂素,也称为前B细胞克隆增强因子,是最近发现的一种新的脂肪因子,主要由内脏脂肪组织产生,具有类胰岛素活性,与肥胖及肥胖相关性疾病有关。内脂素也是一种新的促炎症细胞因子,剂量依赖性上调人单核细胞IL-1β、IL-6和TNF-α表达,各种炎症性疾病血浆内脂素水平增高。此外,内脂素还是一种新的血管炎症介质,可提高THP-1单核细胞MMP-9活性和外周血单核细胞TNF-α和IL-8水平,诱导内皮细胞分泌ICAM-1和VCAM-1,增强内皮细胞MMP-2和-9的活性。在动脉粥样硬化形成和发展的过程中内脂素可能起了一定的作用,有症状患者的颈动脉斑块较无症状患者的颈动脉斑块的内脂素基因表达显著增强;冠心病患者,特别是急性冠脉综合征患者血浆内脂素水平显著增高。内脂素定位于不稳定斑块富含脂质的泡沫巨噬细胞,可能在斑块不稳定过程中发挥重要作用。ET-1是内皮细胞分泌的迄今已知的作用最强的血管收缩肽,能够收缩血管,促进炎症反应,促有丝分裂和增殖,刺激自由基生成和激活血小板。内皮素(ET)-1与高血压、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、糖尿病和冠心病等多种心血管疾病的内皮功能障碍有关。血管内皮损伤刺激ET-1表达,触发内皮黏附、血管平滑肌细胞增殖,最终导致动脉粥样硬化形成。而内皮功能障碍是动脉粥样硬化和血管疾病发病的初期阶段,是心血管事件的独立预测因子。经典观点认为,内皮来源的舒张因子NO、前列环素和内皮依赖性超极化因子的生物利用度降低,引起血管舒张功能受损,导致内皮功能障碍。目前观点认为,ET-1的产生增加和生物活性增强可导致内皮功能障碍。ET-1可能通过降低NO的生物利用度,导致内皮功能障碍。临床研究显示血浆内脂素水平与内皮功能受损相关,2型糖尿病患者血浆内脂素水平与血流介导的血管舒张功能呈显著负相关,发现内脂素可能损害血管内皮功能,但是作用机制未明。尽管最近有研究提出内脂素很可能通过激活NF-κB通路,增加内皮细胞炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1、VCAM-1以及E-选择素基因的表达,引起血管内皮功能障碍,然而内脂素能否诱导血管内皮细胞表达ET-1基因,进而损害内皮功能尚不清楚。本研究旨在观察人重组内脂素对人脐静脉内皮细胞ET-1基因表达的影响,探讨内脂素诱导内皮细胞表达ET-1基因的信号转导机制,为内脂素损害内皮功能、促进AS提供新的依据。研究方法:1、细胞培养:不同浓度内脂素与HUVECs孵育不同时间,收集细胞和细胞培养上清液。抗氧化剂NAC、MEK抑制剂U0126与HUVECs预孵育,再加入500ng/ml浓度的内脂素孵育,收集标本用于指标检测。2、采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞培养上清液ET-1蛋白浓度。3、采用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测内皮细胞ET-1 mRNA的表达水平。4、利用激光共聚焦显微镜进行细胞内ROS检测。5、采用Western blot方法检测内皮细胞细胞外信号调节激酶ERK和磷酸化细胞外信号调节激酶p-ERK的活性。6、采用非放射性电泳迁移实验(EMSA)检测核转录因子AP-1的活性。结果:1、内脂素与HUVECs孵育0、6h、12h和24h,随着孵育时间延长,内皮细胞ET-1蛋白分泌增加,24h时ET-1蛋白浓度最高(42.77±3.80 vs 0.67±0.03,P0.001)。不同浓度内脂素0、50、150、500、1500ng/ml与HUVECs孵育24h,随着内脂素浓度增加,内皮细胞ET-1蛋白分泌增加(19.36±2.56 vs 26.82±1.93,32.58±3.77,42.77±4.16,51.77±4.48,P0.01)。内脂素剂量依赖性上调内皮细胞ET-1蛋白分泌。2、内脂素与HUVECs孵育0、4h、6h和12h,4h内皮细胞ET-1 mRNA水平开始增高(P0.05),6h达到高峰(P0.05),随后下降。不同浓度内脂素0、50、150、500、1500ng/ml与HUVECs孵育6h,随着内脂素浓度增加,内皮细胞ET-1 mRNA表达水平增加(P0.05)。内脂素剂量依赖性上调内皮细胞ET-1 mRNA表达。3、内脂素与HUVECs孵育30min,内皮细胞内ROS水平显著增高(106.51±26.52 vs 27.94±4.18,P0.05)。抗氧化剂NAC预处理内皮细胞,显著抑制内脂素诱导的细胞内ROS增高(43.47±5.22 vs 106.51±26.52,P0.05)。4、内脂素与HUVECs孵育6h,内皮细胞ET-1mRNA表达明显增加(P0.01);NAC预处理内皮细胞,显著抑制内脂素诱导的ET-1mRNA表达(P0.01)。同样,内脂素与HUVECs孵育24h,显著增加内皮细胞ET-1蛋白分泌(40.12±4.72 vs 18.28±2.45,P0.01);NAC预处理内皮细胞,显著抑制内脂素诱导的ET-1蛋白分泌(20.54±2.67 vs 40.12±4.72,P0.01)。5、内脂素与HUVECs孵育0、10min、15min、20min和30min,内脂素诱导ERK p42和p44磷酸化,10min磷酸化反应显著增加,15min达到高峰,随后下降。内脂素与HUVECs孵育15min,内脂素显著增加内皮细胞p-ERK1/2活性;NAC和U0126预处理内皮细胞,显著抑制内脂素诱导的p-ERK1/2活性增加,并抑制内脂素诱导的ET-1 mRNA表达和蛋白分泌。6、内脂素与HUVECs孵育1h,核转录因子AP-1活性增加;NAC和U0126预处理内皮细胞,抑制内脂素诱导的AP-1活性增加。结论:1、内脂素在体外能够剂量依赖性上调HUVECs ET-1基因表达。内脂素很可能通过激活内皮细胞高表达ET-1导致内皮功能障碍。2、内脂素诱导HUVECs产生ROS,抗氧化剂NAC抑制内脂素诱导的ROS增加,并抑制内脂素诱导的ET-1mRNA表达和蛋白分泌。ROS在内脂素诱导的ET-1基因表达中发挥重要作用。3、内脂素激活内皮细胞ERK1/2通路,NAC和U0126可阻断内脂素诱导的ERK1/2通路激活,同时抑制内脂素诱导的ET-1 mRNA表达和蛋白分泌。内脂素激活的ERK通路是氧化还原敏感的信号通路,是内脂素诱导ET-1基因表达的关键环节。4、内脂素增加内皮细胞核转录因子AP-1活性,NAC和U0126可抑制内脂素诱导的AP-1活性增加。AP-1结合序列是内脂素诱导的ET-1基因表达的重要顺式作用元件,氧化还原敏感的AP-1在内脂素诱导ET-1基因表达中起重要作用。ROS通过ROS依赖机制介导AP-1激活,ERK通路参与内脂素诱导的AP-1激活。5、内脂素至少部分通过ROS-ERK介导的AP-1依赖通路上调ET-1基因表达。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
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本文编号：
2806654
