黄连素对波动性高糖致人冠状动脉内皮细胞损伤的保护机制研究

发布时间：2020-08-31 18:34

　　 目的:本课题通过构建波动性高糖对人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells,HCAECs)损伤的模型,研究黄连素(Berberine,BBR)对波动性高糖诱导的人冠状动脉内皮细胞损伤的保护作用,并探究其可能的分子机制。方法:培养HCAECs,将HCAECs分为5组:A组为正常血糖组(5.5mmol/L葡萄糖,NG);B组为持续性高糖组(25mmol/L葡萄糖,PHG);C组为波动性高糖组(5.5mmol/L和25mmol/L葡萄糖每24小时波动一次,IHG);D组为波动性高糖+黄连素干预组(5.5mmol/L和25mmol/L葡萄糖+50μmol/L黄连素每24小时波动一次,IHG+BBR);E组为波动性高渗环境(不加入葡萄糖,加入与IHG相同浓度的甘露醇,保持与IHG相同的波动性高渗环境,OC)。各组细胞每24小时换含2%血清浓度的维持液1次,共培养7天后进行后期实验。用噻唑蓝(MTT)法测定各处理组HCAECs的细胞活力;TUNEL染色及流式细胞术检测细胞凋亡水平;利用相应检测试剂盒分别测定活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等氧化应激标志物水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测白介素-10(IL-10)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等炎症指标的蛋白水平;Western blotting方法检测Caspase-3、NADPH氧化酶4(Nox4)、核因子κB p65(NF-κB p65)、晚期糖基化终末产物(AGEs)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)等蛋白的表达;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1、Caspase-3、Nox4、NF-κB p65、AGEs、RAGE mRNA表达水平。结果:1、细胞活力:与正常血糖组NG组相比,持续性高糖组PHG组细胞活力降低(P0.05);与PHG组相比,波动性高糖组IHG组细胞活力降低更明显(P0.05)。用黄连素干预后,IHG+BBR组较IHG组细胞活力显著增强(P0.05)。2、细胞凋亡:在细胞水平用TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡,在分子水平利用qRT-PCR及Western blotting技术分别检测凋亡效应分子Caspase-3转录及蛋白表达水平。与NG组相比,PHG组细胞凋亡明显增加(P0.05),且IHG组细胞凋亡更加显著(P0.05)。在波动性高糖中加入黄连素,IHG-BBR组较IHG组细胞凋亡明显减少(P0.05)。但波动性高渗环境OC组细胞凋亡不明显(P0.05)。3、炎症反应:与NG组和OC组相比,PHG及IHG组IL-13、TNF-α、MCP-1水平显著升高,相反IL-10表达水平则显著降低(P0.05)。而与PHG组相比,IHG组变化幅度更大(P0.05)。然而,在IHG组中加入黄连素后,IHG+BBR组较IHG组IL-1β、TF-α、MCP-1表达水平明显下调,IL-10表达水平升高(P0.05),表明黄连素干预后炎症反应得到了明显改善。4、氧化应激:与NG组及OC组相比,PHG组及IHG组ROS、Nox4、MDA含量增加,SOD活力下降(P0.05)。但PHG组与IHG组两组间进行比较,IHG组ROS、Nox4、MDA水平较PHG组升高更明显,SOD活力降低更明显(P0.05)。与IHG组比较,IHG+BBR组ROS、Nox4、MDA生成减少,SOD活力出现明显上升趋势(P0.05)。5、NF-κB p65表达:IHG组较PHG组NF-κB p65的蛋白及mRNA表达量均显著增加(P0.05)。然而,与IHG组相比,IHG+BBR组HCAECs的NF-κB p65蛋白和mRNA水平明显下调(P0.05)。6、AGEs及RAGE生成:与PHG组相比,IHG组细胞内AGEs和RAGE的蛋白和mRNA表达量升高(P0.05)。在IHG组中加入黄连素干预,IHG+BBR组较IHG组AGEs和RAGE的蛋白和mRNA表达量明显下降(P0.05)。结论:1、波动性高糖较持续性高糖更易引起人冠状动脉内皮细胞的炎症反应、氧化应激,降低细胞活力,促使晚期糖基化终末产物及晚期糖基化终末产物受体生成,激活NF-κB信号通路,促进细胞凋亡。波动性高糖对人冠状动脉内皮细胞的损伤作用更明显,且损伤作用与渗透压无关。2、黄连素对波动性高糖诱导的人冠状动脉内皮细胞具有明显的保护作用,该作用机制可能与黄连素抑制晚期糖基化终末产物及晚期糖基化终末产物受体生成,减弱NF-κB信号通路下游分子NF-κB p65表达,减轻人冠状动脉内皮细胞的炎症反应及氧化应激相关。
【学位单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2;R54
【部分图文】：

冻存的ＨＣＡＥＣｓ经复苏，在１０％邋ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基中培养２４ｈ后，通过倒置荧光逡逑显微镜观察，ＨＣＡＥＣｓ细胞形态多为椭圆形或多角形，细胞排列紧密，铺满孔底，胞质逡逑丰富，界限清晰，呈“铺路石”样镶嵌排列。见图３－１。逡逑Ａ逡逑图３－１倒置荧光显微镜下观察ＨＣＡＥＣｓ的生长形态（４０Ｘ）逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＣＡＥＣｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋（４０Ｘ邋）逡逑３１逡逑

２．不同葡萄糖培养条件及黄连素干预对ＨＣＡＥＣｓ细胞活力的影响逡逑首先，我们利用ＭＴＴ法检测不同处理条件下ＨＣＡＥＣｓ的细胞活力，我们发现按照不同逡逑条件处理ＨＣＡＥＣｓ后，各组间ＨＣＡＥＣｓ的细胞活力出现了明显差异，结果如图３－２所示。在逡逑持续性高糖环境下细胞活力有所降低，与正常血糖组ＮＧ比较，ＰＨＧ组细胞活力降低（Ｐ＜逡逑０．０５）；但与ＰＨＧ组相比，ＩＨＧ组细胞活力降低程度更明显（Ｐ＜０．０５），说明波动性高糖逡逑较持续性高糖对细胞产生更不利的影响。但是ＩＨＧ＋ＢＢＲ组比ＩＨＧ组细胞活力增强（Ｐ＜０．０５），逡逑提示黄连素干预后，波动性高糖组细胞活力增强，黄连素有效减弱了波动性高糖对ＨＣＡＥＣｓ逡逑细胞活力造成的不利影响。逡逑１２０邋ｒ逡逑Ｈｕｍ逡逑ＭＧ逦ＰＨＧ逦ＩＨ６逦ＯＣ逦ＩＨＧ＋ＢＢＲ逡逑图３－２河丁１＇法检测各组细胞活力（＃与？１＾３对比？＜０．０５；￥与１１＾对比？＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｗａｓ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｂｙ邋ＭＴＴ邋ｍｅ

３．１邋ＴＵＮＥＬ法检测各组ＨＣＡＥＣｓ的凋亡情况逡逑对各组ＨＣＡＥＣｓ进行相应处理后，利用ＴＵＮＥＬ方法检测各组细胞的凋亡情况，结果逡逑如图３－３所示。与正常血糖组ＮＧ对比，ＰＨＧ组细胞发生凋亡情况明显增强，且变化显著逡逑（Ｐ＜０．０５）；而相对于ＰＨＧ组，ＩＨＧ组细胞凋亡情况更加显著（Ｐ＜０．０５），凋亡细胞明逡逑显增多，说明波动性高糖较持续性高糖对细胞的损伤更大；而在波动性高糖环境下添加黄逡逑连素，相较于ＩＨＧ组，其ＩＨＧ＋ＢＢＲ组细胞凋亡情况明显好转（Ｐ＜０．０５），说明黄连素对逡逑由波动性高糖诱发的细胞凋亡具有明显的保护作用，但波动性高渗环境０Ｃ组细胞凋亡情逡逑况较ＮＧ组变化不明显（Ｐ＞０．０５）。逡逑ＮＧ逦ＰＨＧ逦ＩＨＧ逦ＰＣ逦ＩＨＣｒｆＢＢＲ逡逑６０逡逑＾逦Ｍ．逡逑＾逦５０邋－逦＾逡逑c涘蜽逡逑４Ｅ３逦４０逦－逡逑思逦W逡逑Ｓ逦■逦？逡逑ｉＬｍｌｍｌ逡逑ＮＧ逦ＰＨＧ逦ＩＨＧ逦ＯＣ逦ＩＨＧ＋ＢＢＲ逡逑图３－３丁１＾￡１４佥测各组

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