miR-30e-5p靶向BIM调控缺氧诱导人源多潜能干细胞来源心肌细胞凋亡的作用及机制研究

发布时间：2020-08-31 17:24

　　 冠状动脉微栓塞(Coronary Microembolization,CME)被认为是经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)的主要并发症之一。CME会导致冠脉慢血流或无复流,CME还会导致心脏收缩功能障碍和心律失常。因此,CME的发生与心肌梗死面积的进展和患者病情预后的恶化程度密切相关。近年来,微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)与CME期间心肌的凋亡和自噬密切相关;然而,其中的潜在机制尚未完全阐明。miRNA是18-24个核苷酸的内源性非编码RNA,可以通过与靶mRNA的3’-UTR成对结合,在转录后水平负调控靶基因的表达。由于一个miRNA可以靶向多个基因,目前已经发现miRNA可以参与调节多种生化和生理活动。越来越多的证据表明,miRNA具有诊断和治疗心血管疾病的潜力。缺氧可严重改变心肌细胞的miRNA表达谱。以往的研究也报道过自噬与大多数心血管疾病的发生和发展相关。然而,在早期心肌缺氧时,心肌细胞的自噬激活相关研究目前尚未报道。在之前的一项研究中,我们发现,在心梗后,大鼠心肌细胞中有几种miRNA明显下调,其中一个miRNA是miR-30e-5p。这是一种可能参与心肌细胞凋亡和自噬的miRNA。miR-30家族最近被报道参与自噬调控。然而,miR-30e-5p在CME后心肌细胞凋亡和自噬过程中的作用尚不清楚。心肌细胞属于不可再生细胞,由于心脏样本获得的困难和人心肌细胞难以培养,一直以来阻碍着心肌细胞相关研究的进展。目前,大多数研究报告都是利用动物模型来模拟心血管疾病。然而,动物和人类心脏组织之间存在着重要的生物学和病理学差异,尤其是在心肌细胞中。近年来,人源多潜能干细胞来源心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)已成为研究心血管疾病的一个理想模型。hiPSC-CMs的产生为体外直接评估心肌细胞功能提供了一个创新的方法。因此,我们利用一种新的hiPSC-CMs模型来模拟CME期间缺氧诱导损伤的发展。进一步研究miR-30e-5p对hiPSC-CM凋亡和自噬影响的机制。第一部分hiPSC-CMs的获得目的:将人源多潜能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化为hiPSC-CMs,并鉴定其心肌特性和纯度。方法:体外培养将hiPSCs分化为心肌细胞,观察hiPSCs的形态;采用细胞免疫荧光技术鉴定hiPSC-CMs的特性;利用流式细胞技术检测其纯度。结果:传代hiPSCs后细胞呈集落样生长,当汇合度达90%左右时,用试剂盒分化hiPSCs,分化至第10天左右可见成片的自主跳动的hiPSC-CMs,将成片的hiPSC-CMs消化为单个细胞后再接种,继续培养至40天。心肌钙蛋白T(cTnT)特异性标记心肌,利用细胞免疫荧光技术检测hiPSC-CMs的特异性,可见40天的hiPSC-CMs具有结构分明且成熟的肌丝和Z带结构。细胞流式实验结果显示分化hiPSC-CMs的纯度高达85%。第二部分miR-30e-5p在缺氧诱导hiPSC-CMs的凋亡中的表达水平下调目的:通过建立hiPSC-CMs缺氧模型,探索hiPSC-CMs缺氧模型中miR-30e-5p表达水平的变化及凋亡水平。方法:按缺氧时间的长短分组为0h、6h、12h、16h、20h、24h组,每组独立重复3次。将hiPSC-CMs置于缺氧培养箱中培养构建缺氧模型。应用RT-qPCR检测hiPSC-CMs中miR-30e-5p的表达水平,应用Caspase-3活性实验检测hiPSC-CMs的凋亡水平。结果:1.与缺氧0h组相比,缺氧12h、16h、20h、24h组hiPSC-CMs的miR-30e-5p表达水平显著下调(P0.05)。2.与缺氧0h组相比,缺氧24h组hiPSC-CMs的Caspase-3活性显著上调(P0.05)。结论:miR-30e-5p在缺氧诱导的hiPSC-CMs凋亡过程中的表达水平下调。第三部分miR-30e-5p靶向BIM抑制缺氧诱导hiPSC-CMs凋亡目的:研究miR-30e-5p与缺氧诱导hiPSC-CMs凋亡的关系,探讨miR-30e-5p靶向BIM调控缺氧诱导hiPSC-CMs凋亡的作用。方法:将40天hiPSC-CMs分为正常组(N)、缺氧组(H)、过表达对照组(NC+H)、miR-30e-5p过表达组(miR+H)。N组置于正常培养箱下培养;H组置于缺氧培养箱培养24h;NC+H组与miR+H组分别为稳定感染装载有miR-NC和miR-30e-5p的重组慢病毒后缺氧处理24h。应用RT-qPCR检测hiPSC-CMs中miR-30e-5p和BIM的mRNA表达水平,应用Caspase-3活性实验和流式细胞技术检测hiPSC-CMs的凋亡水平。应用钙荧光技术检测hiPSC-CMs的钙瞬变水平,应用Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及靶蛋白BIM的表达水平。利用生物信息学miRNA数据库预测miR-30e-5p的靶基因,并应用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果:1.与N组比较,H组miR-30e-5p表达水平明显下调;与NC+H组比较,miR+H组miR-30e-5p表达水平则明显上调。2.与N组比较,H组Caspase-3活性水平明显升高;与NC+H组比较,miR+H组Caspase-3活性水平下降。3.与N组比较,H组hiPSC-CMs凋亡比例明显上升;与NC+H组比较,miR+H组hiPSC-CMs凋亡比例则明显下降。4.与N组比较,H组hiPSC-CMs钙瞬变的振幅下降和衰减时间延长;与NC+H组比较,miR+H组hiPSC-CMs钙瞬变的振幅提高和衰减时间缩短。5.与N组比较,H组凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3表达水平上调;与NC+H组比较,miR+H组凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Caspase-3表达水平下调。6.与N组比较,H组蛋白BIM表达水平上调;与NC+H组比较,miR+H组蛋白BIM表达水平下调。7.通过miRNA数据库分析发现BIM是miR-30e-5p的潜在靶基因之一;双荧光素酶报告基因实验证实miR-30e-5p能与BIM的3′UTR序列直接结合从而导致荧光素酶活性降低;相反,对应的BIM 3′UTR突变结合位点对荧光素酶活性没有影响。结论:1.miR-30e-5p调控缺氧诱导hiPSC-CMs的凋亡。2.BIM是miR-30e-5p的靶基因之一。3.miR-30e-5p靶向BIM调控缺氧诱导hiPSC-CMs的凋亡。第四部分BIM介导自噬抑制缺氧诱导hiPSC-CMs的凋亡目的:探讨BIM调控缺氧诱导hiPSC-CMs的凋亡的作用机制。方法:检测NC+H组和miR+H组的自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达水平,将40天hiPSC-CMs分为对照shRNA+H组(shNC+H)与shRNA BIM+H组(shBIM+H),shNC+H组与shBIM+H组分别为稳定感染装载有对照shRNA和BIM shRNA的重组慢病毒后缺氧处理24h。应用Caspase-3活性实验和流式技术检测hiPSC-CMs的凋亡水平。应用钙荧光技术检测hiPSC-CMs的钙瞬变水平,应用Western blot检测靶蛋白BIM、凋亡蛋白Caspase-3、自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达水平。结果:与NC+H组相比,miR+H组的自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达水平上升。经过下调BIM表达水平后,与shNC+H组相比,shBIM+H组的Caspase-3活性、心肌细胞凋亡比例、凋亡蛋白Caspase-3下降,而自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达水平上升。结论:BIM通过介导自噬抑制缺氧诱导hiPSC-CMs的凋亡。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R541.4
【部分图文】：

22图 1 hiPSC-CMs 的分化及鉴定A: hiPSCs 在低倍镜下明场的集落样形态；B: hiPSCs 分化第 10 天时，成片状的 hiPSC-CMs 形态；C:消化成单个细胞再接种后 hiPSC-CMs 的形态；D: hiPSC-CMs 的心肌特异性鉴定（红色为 Z 带、绿色为肌丝）。E: hiPSC-CMs 分化的纯度。Figure1 differentiation and identification of hiPSC-CMs (A) The colony-like morphology of the bright fieldof hiPSCs The morphology of 10-day hiPSC-CMs (C) The hiPSC-CMs were digested into individual cells(D) Immunostaining of hiPSC-CMs after 40 days of differentiation and culture: α-actinin (red), cTnT(green), DAPI (blue). (E) Representative flow cytometry result showing the efficiency of hiPSC-CMdifferentiation.

30e-5p 靶向 BIM 调控缺氧诱导人源多潜能干细胞来源心肌细胞凋亡的作用及机制研究 2019 届硕士研究生学实验结果1 miR-30e-5p 表达水平将 40 天的 hiPSC-CMs 分别进行 0h、6h、12h、16h、20h、24h 不的缺氧处理，与缺氧 0h 组相比，缺氧 12h、16h、20h、24h 组 hiPSC- miR-30e-5p 表达水平显著下调（P<0.05）。

C-CMs 的 Caspase-3 活性水平。t of hiPSC-CM viability using Caspase-3 activity miR-30 家族中的一员，它包含了 md 和 miR-30e 五个独立的 miRNA。mi泛参与多种心血管疾病的发病机制[28-3力衰竭、心肌梗死、心肌肥厚及缺血/再明 miR-30 家族在心肌缺血损伤[33]的保p 在缺氧后 hiPSC-CMs 损伤中的具体作通过构建 hiPSC-CMs 缺氧模型，miR-30e-5p 表达水平从缺氧 12h 开始

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本文编号：2809109