糖基化CD147在心肌肥厚向心力衰竭转化中的作用及其机制研究

发布时间：2020-09-01 18:02

　　高血压是严重威胁人类健康的临床综合征,其发病率呈逐年递增。高血压引起的心脏慢性压力超负荷导致心肌肥厚,由于持续血压增高,可以引起慢性心脏压力过载,从而造成失代偿性心力衰竭。但是其发生的具体机理,迄今仍未完全阐明。Woodiwiss等研究发现,慢性压力超负荷致肥厚心脏的纤维化程度增加,在代偿性心肌肥厚阶段,胶原交联度保持正常或略增高水平,然而,在心力衰竭阶段胶原交联度显著降低,且与左心室扩张呈正相关,提示胶原交联度降低在心肌肥厚向心力衰竭的转化过程中发挥着重要的作用。在此转化过程中,何种因素引起胶原交联度降低,目前尚不清楚。心肌胶原交联度的调节受赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)和金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)共同决定。LOX增加胶原交联度,相反,MMPs降低胶原交联度。Woodiwiss等研究表明,心室扩张阶段LOX活性不变或略升高,而MMPs的活性却大幅升高。据此推测,MMPs是降低肥厚心肌胶原交联度的主要原因。心肌细胞包含一种重要的跨膜分子CD147,在单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1,MCT 1)的协助下装配于细胞膜以及在调节其表达过程中发挥协调作用。另一方面,CD147分子胞外结构域包含3个糖基化位点(Asn44、Asn152、Asn186),可以发生不同程度的N-糖基化,糖基化的CD147分子则是MMPs的激活因子。高血压除通过慢性压力超负荷引起心肌肥厚外,血管紧张素II(angiotensin II,AngⅡ)浓度持续增加,亦是促心肌肥厚的重要因素。不仅如此,AngⅡ还可能促进CD147的糖基化。目前关于CD147在心力衰竭中的研究较少,本研究通过探索CD147在心肌肥厚向心力衰竭转化中的作用以及信号转导通路,可能为揭示心力衰竭的发生提供实验数据。一、肾性高血压大鼠心肌CD147表达与糖基化水平升高我们成功建立了两肾一夹(two-kidney one-clip,2K1C)大鼠模型,评估术后20 w的大鼠模型,并检测相关的功能以及分子表达。检测结果显示:大鼠左肾质量与右肾质量之比、血浆以及心肌组织的AngⅡ含量,以及心脏质量体重之比都符合模型建立成功的标准。颈动脉插管测量血压显示,2K1C大鼠血压出现上升。超声结果显示,肾性高血压大鼠术后20 w出现心功能下降,但未进入心力衰竭阶段。进一步检测大鼠肝脏质量与体重之比、肺脏质量与体重之比、肝脏干湿重之比、肺脏干湿重之比以及心肌肥厚标志物心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP),结果提示,大鼠发生代偿性的心肌肥厚。免疫荧光以及蛋白检测结果显示:2K1C大鼠CD147表达以及糖基化水平升高。Masson染色结果显示,2K1C组心肌纤维化程度增加。电镜观测以及羟脯氨酸测定显示,2K1C大鼠胶原含量增加。明胶酶谱以及蛋白表达结果显示,2K1C组MMP-2、MMP-9活性以及表达增加,同时2K1C组I型胶原含量升高而III型胶原含量降低。进一步检测心肌胶原交联度,结果发现:2K1C组大鼠胶原交联度出现下降。二、肥厚心肌AngⅡ调节CD147蛋白表达与糖基化程度的分子机制我们在细胞水平对于CD147表达以及糖基化的具体机制进行了探讨,分离新生大鼠的心肌细胞,利用心肌细胞标志物肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2,MLC-2)对心肌细胞进行了鉴定,确保高纯度的细胞用于后续的实验。给予心肌细胞不同浓度的AngⅡ刺激,在基因和蛋白水平检测CD147的表达,筛选出AngⅡ刺激的最佳浓度为10~(-8) mol/L,后续实验采取此浓度对细胞进行处理。免疫荧光显示,给予细胞AngⅡ刺激,CD147的表达以及糖基化水平增高。同时,加入AngⅡ刺激,肥厚标志物ANP的表达增加。分别给予心肌细胞AT1受体和AT2受体的拮抗剂,PCR以及免疫印迹结果显示,AngⅡ经AT1受体增加CD147表达。进一步使用蛋白激酶Cε(protein kinase Cε,PKCε)的抑制剂以及激动剂对AT1受体的下游分子进行检测,PCR结果以及免疫印迹显示,AngⅡ激活PKCε增加CD147的表达。接下来探讨PKCε的下游分子,使用N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)的抑制剂以及激动剂,PCR以及免疫印迹结果显示,AngⅡ激活GnT-V增加CD147表达。本部分研究证实:AngⅡ经AT1、PKCε、GnT-V参与CD147糖基化的调节。综上所述,在动物整体水平,借助2K1C大鼠模型,证实高浓度的AngⅡ在心肌局部情况下,CD147表达以及糖基化程度增加,同时心肌间质纤维化增加。CD147的糖基化程度增加后可以激活MMPs,进而破坏胶原代谢平衡,使得胶原交联度降低,从而促进肥厚心肌向心力衰竭转化。在心肌细胞水平,探明CD147表达以及糖基化水平增加的信号转导通路为:AngⅡ通过与AT1受体结合,激活PKCε转位进入高尔基体,进而激活CD147糖基化的关键酶GnT-V,从而诱导CD147的表达以及糖基化水平增加。本研究揭示并完善CD147在心力衰竭发生中的作用以及调控CD147的信号转导通路,并为基于靶向CD147的心力衰竭治疗提供了新的理论参考。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.2
【部分图文】：

信号转导通路,过程,心血管功能,自噬

心肌肥厚伴随心肌细胞的改变，包括钙超载、新陈代谢和胚增加，同时细胞凋亡和自噬增加，还包括细胞外基质(extracellul化和血管生成增加。在心肌肥厚代偿期，心脏最初会对额外的负，通过增加心脏体积和质量，同时伴随生物化学、分子、结构和代谢使得心室壁应力正常化，并使心血管功能保持正常。而到了失代偿室扩张和心功能障碍，细胞凋亡以及电生理的改变，心肌出现过生成异常，出现过量自噬。在持续的压力刺激下，随着时间的推移不可逆的阶段，心脏功能最终衰竭（图 1）[8]。衰竭时机体的代偿反应无法将心血管功能恢复正常，所以预防心转化应该成为防治心力衰竭的重点环节。尽管在研究高血压的发人员做了很多工作，但心肌肥厚向心力衰竭转化潜在的细胞和分子。

信号转导通路,心肌肥厚

Rs是跨膜蛋白家族，在心脏应激和心衰的环境中通常会改变。GPCRs受体与异三聚体G蛋白的相互作用而发生。异三聚体G蛋白由三个亚基Gαq，Gαi，Gαs)，Gβ和Gγ。在心脏中，Gαq在调节病理性心肌肥厚中起αq还与钙调蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II, Ca有关，可以导致内钙的激活。Gαq调节不良心脏生长的关键作用在转基有相关的研究，心脏特异性过表达Gαq的小鼠出现心衰以及过早死以形成两条主要的信号转导通路：GPCR-Gs/Gi-AC-cAMP-PKA与GPCDAG-PKC信号转导通路[9]。/细胞因子包括 AngII、内皮素-1（endothelin-1,ET-1）和 α-肾上腺素受甲肾上腺素)，分别与 AngII 的 I 型受体（AT1 受体）、内皮素受体（Eα1 肾上腺素受体（adrenergicreceptors,ARs）结合，激活许多下游信号蛋酶 C（PLC）、PKC 和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteink。

糖基化,运输过程,细胞内

空军军医大学博士学位论文 LG-CD147 结合，抑制其成熟，并将其送入细胞膜。膜上并诱导 MMPs 分泌[25]。然而，亦有报道 Caveolin-1 促进 CCD147 易位到细胞膜，高尔基体中的 cyp60 是促进 CD14的 CD147 在细胞膜上以寡聚体的形式存在，小部分跨膜 C外基质中作用于邻近细胞。两种类型的成熟 CD147 均能CD147 在内质网成熟过程中伴随的辅助蛋白之一，它们CT 复合物，具有 MMPs 诱导与乳酸输出的双重作用[28, 的高糖基化/低糖基化的比值。据报道，可以在细胞膜上7 和 LG-CD147。也有研究表明，只有高糖基化的 CD 14胞[30]的细胞膜上检测出来。作为一种跨膜蛋白，高糖基化生物功能的主要形式。相比之下，肝癌细胞中稳定存在的其他细胞生理功能还有待进一步研究。

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