去泛素化酶BRCC36对小鼠心肌梗死后心肌细胞DNA损伤修复及心肌重构的影响及机制

发布时间：2020-09-21 07:16

　　目的:探讨去泛素化酶BRCC36在小鼠心肌梗死后心肌细胞DNA损伤修复及心肌重构中的作用及其作用机制。方法:1)通过商业化服务构建心肌细胞特异性过表达BRCC36的转基因小鼠(α-MHC-BRCC36),利用PCR、Western blot方法进行鉴定并筛选心肌细胞特异性过表达BRCC36的阳性转基因小鼠。2)取8-10周上述转基因小鼠,采用结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支(Left anterior coronary artery,LAD)的方法构建心肌梗死模型,同时取8-10周野生型C57小鼠作为对照组。实验分组:野生假手术组(WTSham,n=15)、野生手术组(WTMI,n=47)、转基因假手术组(TGSham,n=15)、转基因手术组(TGMI,n=29)。3)心肌梗死模型构建成功后继续饲养4周,统计每组小鼠存活率;通过超声心动图检测小鼠心脏功能;通过TTC染色检测小鼠心脏梗死范围。4)通过TUNEL染色方法检测心肌细胞凋亡比例,并通过Western blot方法检测凋亡相关蛋白的表达情况。5)采用实时定量PCR(Real-time PCR)的方法检测细胞外基质中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)及骨膜蛋白(Periostin)的表达情况,并通过天狼猩红染色、Masson三色法染色检测LAD术后心肌纤维化的情况,通过Western blot方法检测TGFβ信号通路中Smad3磷酸化情况及细胞外基质中collage-Ⅲ的表达情况。6)通过Western blot检测LAD术后DNA损伤标志物γH2AX及DNA修复因子RAD51蛋白的变化情况。结果:1)通过PCR方法对转基因小鼠基因型进行鉴定,筛选阳性小鼠,并通过Westernblot的方法检测蛋白水平表达情况发现,基础状态下转基因小鼠心脏中BRCC36蛋白表达明显增高。2)结扎小鼠左冠状动脉前降支,观察小鼠心电图,发现ST段显著抬高。LAD术后28天,统计每组小鼠存活率发现,与野生手术组小鼠相比,转基因手术组小鼠存活率明显增高(53.19%vs 79.31%)。通过TTC染色检测小鼠LAD术后心肌缺血面积,发现与野生型手术组相比,转基因手术组小鼠心肌缺血面积明显减少。3)通过超声心动图检测小鼠LAD术后心脏功能,结果显示:与假手术组相比,手术组小鼠心脏左心室收缩末期内径(Left ventricular internaldimension systole,LVIDs)、左心室舒张末期内径(Left ventrcular internal diameter diastole,LVIDd)明显增加,左心室射血分数(left ventricular ejcction fraction,LVEF)、短轴缩短率(shortening fraction,FS%)明显降低,心脏功能明显降低。与野生型手术组相比,转基因手术组小鼠的心脏功能明显改善。观察每组小鼠LAD术后28天心脏大小,发现野生型手术组小鼠心脏比转基因手术组小鼠心脏明显增大。计算小鼠心脏体重比值发现,野生型手术组小鼠的指标比转基因手术组小鼠明显增大。4)通过天狼猩红染色和masson三色法染色,检测小鼠LAD术后小鼠心肌纤维化的情况,发现手术组小鼠心肌纤维化明显加重,与野生型小鼠相比,转基因手术组小鼠心肌纤维化明显降低。通过实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)方法检测细胞外基质中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、骨膜蛋白(Periostin)的表达,发现LAD术后小鼠细胞外基质分子CTGF、Periostin的表达明显增高,而转基因手术组小鼠细胞外基质的表达明显低于野生型小鼠。Western blot检测细胞外基质中胶原蛋白-Ⅲ(collage-Ⅲ)表达发现,转基因手术小鼠中collage-ⅢⅢ的表达明显低于野生手术组,且P-Srmad3的表达也明显低于野生手术组。5)通过TUNEL染色法检测小鼠LAD术后心肌细胞凋亡的比例,结果显示,LAD术后小鼠心肌细胞凋亡比例明显增加,而与野生型手术组相比,转基因手术组小鼠心肌细胞凋亡比例明显低于野生型小鼠手术组。Western blot检测凋亡蛋白发现,LAD术后抗凋亡蛋白Bcl-2、P-Bad、Mcl-1的表达明显降低,促凋亡蛋白Puma、caspase-3的表达明显增高,而转基因手术组小鼠抗凋亡蛋白的表达明显高于野生型手术组小鼠,促凋亡蛋白的表达明显低于野生型转基因小鼠。6)为了检测BRCC36对小鼠LAD术后心肌细胞DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)的影响,通过Western blot的方法检测DNA损伤标志物γH2AX及DNA损伤修复因子RAD51的表达情况,结果发现,LAD术后小鼠心肌细胞DNA损伤标志物γH2AX的表达明显增高,DNA损伤修复因子RAD51的表达明显降低,而与野生型手术组相比,转基因手术组小鼠DNA损伤标志物γH2AX的表达明显降低,而DNA损伤修复因子RAD51的表达明显增高。结论:心肌细胞特异性过表达BRCC36可显著改善心肌梗死后心脏病理性重构,改善心脏功能,这可能与其降低TGFβ诱导的Smad3磷酸化及促进DNA损伤修复有关。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

心电图,小鼠,存活率

状动脉前降支构建心肌梗死模型是目前研宄心肌梗死常用的实验方法，按照实验方法中构逡逑建心肌梗死模型的方法构建模型后，连接生物信号处理系统，检测此时小鼠的心电图，可逡逑以发现，野生手术组及转基因手术组心电图ＳＴ段明显抬高，如图２－Ａ所示，表明心肌梗逡逑死模型构建成功。心肌梗死模型构建成功后，每天观察每组小鼠存活情况，及时发现小鼠逡逑死亡并进行解剖确定小鼠死亡原因，记录每组小鼠的生存死亡情况。继续词养２８天，发逡逑现手术组小鼠的死亡时间都集中在手术后第一周，一周后两组小鼠都没有在出现死亡，结逡逑果如图２Ｂ所示，可以发现转基因小鼠术后存活率明显高于野生手术组（７９．３１邋％邋ｖｓ邋５３．１９％，逡逑Ｐ＜０．０５）。这个结果表明心肌细胞特异性过表达ＢＲＣＣ３６可以明显改善小鼠心肌梗死术后逡逑存活率。逡逑

心电图,心肌梗死,小鼠,心肌梗死面积

图２：检测小鼠心肌梗死术后小鼠存活率。Ａ：检测心肌梗死术后小鼠心电图，发现手术组小鼠心电图逡逑ＳＴ段明显抬高。Ｂ：心肌梗死术后２８天，小鼠存活率的分析。ＷＴＭＩ野生手术组ｎ＝４７；邋ＴＧＭＩ转基逡逑因手术组邋ｎ＝２９，邋＊邋Ｐ＜０．０５。逡逑３．３心肌细胞特异性过表达ＢＲＣＣ３６减少小鼠心肌梗死后心肌梗死面积逡逑为了研究ＢＲＣＣ３６对心肌梗死小鼠模型心肌梗死面积的作用，我们在心肌梗死模型构逡逑建成功后继续词养２８天，麻醉处死小鼠，生理盐水灌注，清洗心脏组织中的血液，取手逡逑术结扎部位以下心脏组织２ｍｍ厚度，放入预冷的生理盐水中清洗。用ＰＢＳ配置１％的ＴＴＣ逡逑染料，避光保存，现配现用。使用前放入３７度温箱中孵育１５ｍｉｎ，将清洗好的心脏组织放逡逑入１％的ＴＴＣ染料中，３７度避光孵育３０ｍｉｎ。孵育结束后将心脏组织放入４％的多聚甲醛逡逑中固定１小时。可以发现缺血梗死区域的心脏组织变白，而正常组织呈红色。与假手术组逡逑相比，手术组小鼠都出现了明显的梗死区域，但是与野生手术组相比，转基因小鼠心肌梗逡逑死缺血区域明显减少，这个结果表明心肌细胞特异性过表达ＢＲＣＣ３６可以明显缩小心肌梗逡逑死模型小鼠梗死区域面积。逡逑

超声心动图,超声心动图检测,心脏功能,心肌梗死

图４超声心动图检测心肌梗死术后小鼠心脏功能。Ａ：心肌梗死术后小鼠超声心动图代表图；Ｂ－Ｅ：统逡逑计每组小鼠超声心动图心脏功能指标，ＬＶＩＤｄ：左心室舒张末期直径；ＬＶＩＤｓ：左心室收缩末期直径；逡逑ＦＳ：左心室短轴缩短率；ＬＶＥＦ：左心室射血分数；Ｆ：各组小鼠心脏体重比值；Ｇ：各组小鼠心肌梗死逡逑术后整体观。＊＊ｐ＜0．0ｌｖｓＷＴＳｈａｍ，邋＃ｐ＜０．０５ｖｓＷＴＭＩ。逡逑３．５心肌细胞特异性过表达ＢＲＣＣ３６减轻小鼠心肌梗死术后心肌纤维化逡逑为了研究ＢＲＣＣ３６对心肌纤维化的影响，我们构建心肌梗死模型成功后２８天将小鼠逡逑麻醉后处死小鼠，心脏灌流。留取结扎部位的左心室，４％的多聚甲醛固定，制作石蜡切片。逡逑通过天狼猩红染色、ｍａｓｓｃｍ三色法染色检测心肌纤维化的情况，结果发现，与假手术组相逡逑１：匕，心肌梗死术后小鼠心肌纤维化明显加重，与野生型手术组小鼠相比，转基因手术组小逡逑鼠天狼猩红染色、ｍａｓｓｏｎ三色法染色中心肌纤维化明显减轻；通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法检测逡逑ＥＣＭ中ＣＴＧＦ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ的表达情况，发现转基因手术组小鼠细胞外基质ＣＴＧＦ、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ逡逑的表达明显低于野生型小鼠。同时通过ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法检测心肌梗死术后心脏组织中逡逑ＢＲＣＣ３６蛋白的表达情况，发现心肌梗死术后ＢＲＣＣ３６的表达明显降低，而转基因手术组逡逑小鼠ＢＲＣＣ３６的表达明显高于野生型手术组小鼠；同时检测ＴＧＦ（３信号通路中Ｓｍａｄ３的逡逑

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