EphrinB2信号介导PTH诱导的主动脉内皮细胞—间充质转分化的实验研究

发布时间：2020-09-21 13:57

　　 【研究背景】研究发现PTH诱导的End MT是介导CKD主动脉钙化形成的重要机制之一,而PTH诱导End MT的机制目前仍不十分清楚。既往证据表明,PTH干预可上调Ephrin B2表达,而Ephrin B2/FAK信号通路参与上皮细胞间充质转分化,但Ephrin B2/FAK信号通路是否参与介导End MT尚不明确。【研究方法】1.第一部分:Ephrin B2对PTH诱导HAECs发生End MT的影响。体外培养原代人主动脉内皮细胞(HAECs):(1)分四组:1)PTH浓度为0mol/L的对照组2)PTH浓度为10-9 mol/L的干预组3)PTH浓度为10-8 mol/L的干预组4)PTH浓度为10-7mol/L的干预组,培养48h,real-time PCR、WB、共聚焦检测Ephrin B2、End MT相关标志物的m RNA和蛋白的表达,WB检测磷酸化Ephrin B2的表达;(2)细胞分为:1)PTH+错义si RNA干预组(PTH 10-7mol/L+Vehicle)2)PTH+Ephrin B2si RNA干预组(PTH 10-7mol/L+si RNA),培养48h,检测End MT相关标志物的m RNA和蛋白表达。2.第二部分:Ephrin B2是否通过激活FAK信号介导PTH诱导的End MT。(1)细胞分为四组:1)对照组(CTL组)2)PTH干预组(PTH 10-7mol/L)3)PTH+错义si RNA干预组(PTH 10-7mol/L+Vehicle)4)PTH+Ephrin B2 si RNA干预组(PTH 10-7mol/L+si RNA)。培养48h,WB检测FAK及磷酸化FAK表达水平,共聚焦检测磷酸化FAK、CD31的表达。(2)细胞分为两组:1)PTH+错义si RNA干预组(PTH 10-7mol/L+Vehicle)2)PTH+FAK si RNA干预组(PTH10-7mol/L+si RNA),培养48h,检测End MT相关标志物的表达。【研究结果】1.第一部分:(1)PTH干预能够呈浓度依赖性上调间充质标志物FSP1和α-SMA的m RNA及蛋白水平,同时下调内皮细胞标志物CD31和VE-Cadherin的m RNA和蛋白水平。PTH能够呈浓度依赖性上调HAECs的Ephrin B2的蛋白水平及Ephrin B2的磷酸化水平。共聚焦结果示:对照组(CTL组)HAECs高表达内皮细胞标志物CD31,少量表达Ephrin B2;而PTH干预组HAEC变纤长,有些细胞甚至失去CD31表达,但Ephrin B2表达增加。(2)与PTH+Vehi组细胞相比,PTH+Ephrin B2 si RNA干预组细胞的CD31和VE-Cadherinm RNA和蛋白表达上调,FSP1和α-SMA的m RNA和蛋白表达水平明显降低。2.第二部分:(1)PTH干预上调磷酸化FAK的水平,升高磷酸化FAK与FAK比值,但FAK的表达未明显改变。与PTH+Vehi组细胞相比,PTH+Ephrin B2 si RNA干预组HAECs的磷酸化FAK蛋白表达水平明显降低,磷酸化FAK与FAK比值亦明显降低。共聚焦示:与CTL组相比,PTH+Vehi组细胞CD31的绿色荧光强度减弱,磷酸化FAK的红色荧光强度明显增强,Ephrin B2 si RNA干预后,磷酸化FAK红色荧光强度较前减弱且CD31较PTH+Vehicle组增强。(2)与PTH+Vehicle组细胞相比,PTH+FAK si RNA干预组细胞的CD31、VE-Cadherin m RNA和蛋白表达水平上调,FSP1和α-SMA的m RNA和蛋白表达水平明显降低。【研究结论】Ephrin B2/FAK信号径路参与介导PTH诱导的人主动脉内皮细胞的End MT,应用Ephrin B2 si RNA或FAK si RNA抑制该信号径路的活化能够部分阻断PTH诱导的End MT相关标志物的表达。该研究结果有助于进一步阐明PTH促进End MT形成的机制,为临床早期防治CKD血管钙化供了新方向,同时也为认识EphrinB2/FAK信号通路在其它方面的作用供了思路。
【学位单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R543
【部分图文】：

图1 EphrinB2下游信号传导图示TH 可以上调小鼠骨髓基质干细胞 EphrinB成骨细胞分化[13]。新的研究表明，EphrinB2未检测到 EphrinB2 mRNA，而人脑海绵状，该病变处的免疫组化示内皮细胞 EphrinB信号的激活诱导 EndMT，这一过程中 Ephr肠癌的体外实验表明 EphrinB2 磷酸化后通质转分化（epithelial-to-mesenchymal transit维化及心脏纤维化的相关研究中，Ephrin-化、促进细胞外基质的分泌[17-18]，而 EndM多。以上研究 示 Ephrin-B2 可能在 EndM景，本研究拟观察 PTH 干预下人主动脉内

东南大学硕士学位论文注：实时定量 PCR，n=3, *P＜0.05 vs. PTH 浓度为 0mol/L 对照组。。图 1 PTH 对 HAECs EndMT 相关标志物 mRNA 表达的影响PTH（mol/L） 0 10-1010-910-810-7

5.2 PTH对内皮细胞EphrinB2表达及磷酸化水平的影响：正常状态下，EphrinB 家族中， EphrinB2 主要表达于 HAECs（见图 3A不同浓度的 PTH（0，10-9，10-8，10-7mol/L）干预细胞 48h。Real-time PCR 显示，PTH 能上调 EphrinB2 mRNA 的表达，且 10-7mol/L 浓度干预下，上调显著（见图 3B）。Western Blot 结果显示 PTH 能够呈浓度依赖性上调 HAE的 EphrinB2 的蛋白水平及 EphrinB2 的磷酸化水平（见图 4）。且 PTH 浓度10-7mol/L 干预组，细胞内 EphrinB2 及磷酸化 EphrinB2 的蛋白水平与对照组比均出现显著的统计学差异（*P＜0.05 vs. PTH 浓度为 0mol/L 对照组）。用10-7mol/L 浓度的 PTH 干预 HAECs 48 小时后，用共聚焦荧光显微镜观察发对照组（CTL 组）HAECs 高表达内皮细胞标志物 CD31，少量表达 EphrinBPTH 干预组 HAEC 变纤长，有些细胞甚至失去 CD31 表达，且 EphrinB2 表达加（见图 5）。以上 示 EphrinB2 信号蛋白的激活可能参与 PTH 诱导的 EndM

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1 吴

本文编号：2823571