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miR-20a通过靶向PKG1的编码区调控人肺动脉平滑肌细胞的表型的转换

发布时间:2020-09-21 14:54
   背景:缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是慢性阻塞性肺疾病和高原心脏病等疾病发生的重要病理基础。慢性缺氧最终会导致肺血管重建,此过程伴随着肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)从具收缩能力的分化表型向强增殖能力的合成表型的转换。近年来研究表明,micro RNA(mi RNA)通过影响PASMCs的分化、增殖、迁移和凋亡等方面,在肺血管重建中起重要的调控作用。然而,目前对于mi RNA在缺氧条件下调控PASMCs的分子机制的认识仍然十分有限。目的:研究mi R-20a在缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞表型转换中的作用及调控机制。方法和结果:首先,通过定量PCR检测,发现mi R-20a在缺氧诱导的肺高压小鼠的肺组织和肺动脉中的表达显著上调;对体外培养的人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells,HPASMCs)进行缺氧处理,发现mi R-20a的表达也显著上调;在HPASMCs中分别过表达或抑制mi R-20a,通过Ed U掺入实验、划痕实验及western blot方法分析其对HPASMCs功能的影响,发现mi R-20a能够抑制分化表型蛋白calponin、α-SMA、Smoothelin、MHC和SM-22的表达,促进细胞的增殖和迁移;以上结果表明mi R-20a在缺氧诱导的HPASMCs中表达上调,并促进细胞向去分化表型转换。其次,通过定量PCR和western blot方法,验证了与HPASMCs分化表型维持密切相关的c GMP依赖性蛋白激酶1(PKG 1)的m RNA和蛋白表达在缺氧条件下均显著下调;通过western blot检测发现在HPASMCs中过表达或抑制mi R-20a能够分别下调或上调PKG 1的蛋白表达水平,提示PKG 1可能是mi R-20a的靶基因;通过双荧光素酶报告基因分析,发现mi R-20a对PKG 1的3’-UTR及启动子没有明显的调控作用,进一步分析PKG 1的编码序列,通过定点突变和western blot检测,证明mi R-20a通过靶向PKG 1编码区的两个高保守的识别位点,在转录后水平上抑制其蛋白表达;细胞功能实验结果表明,PKG 1能够促进分化表型蛋白的表达,并抑制细胞的增殖和迁移,使细胞向分化表型转换;此外,通过定量PCR检测先天性心脏病相关的肺动脉高压患者血清中的mi RNA变化,发现mi R-20a的表达显著上调,提示其可能作为潜在的循环标志物在肺动脉高压的临床诊断中发挥作用。结论:本研究发现了mi R-20a在缺氧诱导的HPASMCs中表达上调,证明了其通过靶向PKG1编码区抑制其蛋白表达,从而促进细胞的增殖、迁移,使细胞向去分化表型转换。研究结果不仅揭示了缺氧下调PKG 1的表达及促进HPASMCs表型转换的分子机制,也为肺动脉高压的临床诊断和治疗提供了新思路。
【学位单位】:深圳大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2015
【中图分类】:R544.1

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