基因-环境交互及表观遗传作用对血脂异常及冠心病影响的相关研究

发布时间：2020-09-21 22:14

　　 第一部分BCL3-PVRL2-TOMMM40基因簇单核苷酸多态性、基因-基因和基因-环境交互作用对血脂异常的影响背景:随着物产资源的丰富,人们生活水平的提高,伴随而来的心血管疾病发病人群的不断增多,给世界各国的人民带来巨大的经济负担和社会负担。根据世界卫生组织的统计,心血管疾病已成为全世界范围内人群发病致死的首要原因。引起心血管疾病的主要原因为动脉粥样硬化,而血脂异常是致动脉粥样硬化的重要原因,有效的防治血脂异常对减少动脉粥样硬化,乃至心血管疾病的防控工作具有决定性意义。根据近来的研究报告,血脂水平受多种因素的共同作用,其中环境因素、遗传因素以及环境-遗传因素相互作用的影响不可忽视。随着研究的进一步深入,几宗大型全基因组关联研究定位了一些新的、可能与血脂有关的基因,但这些基因与血脂水平的关系尚需进一步验证。其中有B细胞白血病/淋巴瘤-3基因(BCL3[MIM109560])、脊髓灰质炎病毒受体相关基因-2(PVRL2[MIM600798])和外线粒体膜基因转座酶基因(TOMM40 MIM[608061])等,它们与血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及总胆固醇(TC)的变化程度具有一定关联。我国幅员辽阔,民族众多,毛南族是55个少数民族其中之一,也是广西壮族自治区特有的几个少数民族之一。毛南族居住的地理环境、生活习性、饮食结构、聚居特点都与本地居住的汉族居民存在差异。其族内通婚的风俗世代相传,从而使其遗传背景区别于当地的汉族,是研究群体遗传作用、环境影响、基因-基因和基因-环境交互作用较为理想的族群。我们选择了12个曾在欧洲人群为背景的研究中被证实与血脂有关的单核苷酸多态性(SNP)位点,这些位点均位于BCL3-PVRL2-TOMM40基因簇内。通过基因分型,确定基因-基因,基因-环境的交互作用对毛南族人群血脂水平的影响,探讨血脂异常发生的原因,为进一步防治动脉粥样硬化乃至心血管病的发生发展具有重价意义。目的:了解广西环江毛南族自治县毛南族人群血脂水平分布情况及差异,分析血脂正常,异常两组人群BCL3-PVRL2-TOMM40基因簇SNPs以及它们的单倍体与血脂水平的相关关系,探讨性别、年龄、环境作用、遗传因素以及环境-遗传因素相互作用对血脂异常发生的影响。方法:按照国际流行病学同行的调查方法,对聚居于广西西北部环江毛南族自治县上南、中南和下南山区的毛南族居民进行分层(性别和年龄)随机抽样,抽取祖宗三代均为毛南族并经Y染色体和线粒体多样性研究证实的居民作研究对象,记录起居饮食习惯,身高体重等信息,并对研究者进行研究相关的生活方式、既往发病情况的问卷调查和体格检查。禁食12小时后,抽取静脉血,部分血分离血清,用于测定甘油三酯(TG)、TC、HDLC、LDL-C,载脂蛋白(Apo)A1及Apo B水平,并计算Apo A1/Apo B比值。测量身高体重后计算体重指数(BMI)。安静状态下记录血压情况,记录数据包括收缩压(SBP)和舒张压(DBP),并计算脉压差(PP)。另一部分血用于提取DNA,测定基因型。本研究在上述前期分层随机抽样调查完成的研究建立的标本库中随机抽取毛南族1962人,根据2017中国成人血脂防治指南中血脂异常诊断标准,将这两组人群分为血脂正常组及血脂异常组。这两组人群的性别和年龄构成比较差异无统计学意义。用聚合酶链式反应和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)等方法对BCL3-PVRL2-TOMM40基因簇12个单核苷酸多态性位点(BCL3 rs2965101、rs4803748、rs2965169和rs8100239,PVRL2 rs10402271、rs3810143、rs519113、rs6859和rs283810,和TOMM40 rs157580、rs2070650和rs439401)进行基因分型,用过Sanger测序,对PCR产物基因型结果进行验证。分析BCL3-PVRL2-TOMM40 SNPs各基因型及等位基因频率在两组人群,不同性别中的分布以及与血脂水平的关系。评估两组人群的基因型,等位基因以及一些环境因素与血脂水平的相关性。为了分析基因遗传因素对血脂异常的影响情况,计算各位点间的连锁不平衡情况(LD)并以r2值或D'值进行描述。构建单倍体判断基因间的交互情况,以上方法通过Haploview 4.2软件分析并完成。为进一步明确基因-基因和基因-环境交互作用对血脂异常发病的贡献程度,用广义多因子降维分析方法(GMDR)分析各位点与环境暴露因素之间的关系。结果:比较两组人群的血脂水平后发现,在血脂异常组中,BMI、吸烟和饮酒比率、空腹血糖、血清TC、TG和LDL-C水平高于正常组,而HDLC水平、Apo A1/Apo B比值在血脂异常组中低于正常组(P0.05-0.001)。两组人群在年龄、性别、身高、BMI、腰围(WC)、BP、DBP、PP、Apo A1和Apo B方面没有观察到差异(P0.05)。这两组人群中的基因型和等位基因频率存在差异(P0.05-0.001),且所有的基因突变均符合HardyWeinberg平衡(HWE,P0.05)。进一步分析基因模型对血脂异常发病的影响后发现,rs8100239和rs157580 SNPs的显性模型对于血脂异常的发生具有保护作用,而rs10402271、rs3810143、rs519113和rs6859 SNPs的显性模型则表现出增加患病做用(P0.05-0.001)。同时,一些SNPs能引起相应的血脂变化,在血脂异常组中的关系为:TC(rs2965101、rs4803748、rs2965169、rs8100239、rs519113、rs6859、rs157580、rs2075650和rs439401),TG(rs2965101、rs8100239、rs10402271、rs3810143、rs6859、rs283810和rs157580);LDL-C(rs2965101)。然而,在血脂正常组人群内则观察到的相关性为:TC(rs2965169、rs519113和rs157580);TG(rs2965101、rs8100239、rs6859和rs157580;P0.004-0.001)。多基因间连锁不平衡(LD)分析阐明了在这两组人群中,检测位点之间存在统计学的非独立性。其中,最常见的单倍型是BCL3 A-C-A-T,PVRL2 A-A-GG-A和TOMM40 T-A-T(30%的比例)。携带BCL3 A-T-C-A、BCL3 AT-C-T、PVRL2 A-A-C-A-A、PVRL2 A-A-C-A-C、PVRL2 A-A-G-G-A、PVRL2C-G-C-A-A、PVRL2 C-G-C-A-C、TOMM40 C-A-C、TOMM40 C-A-T和TOMM40 T-A-T单倍型的比率在血脂异常和正常组人群之间存在差异。同时,携带BCL3 A-T-C-A、PVRL2 A-A-C-A-C、PVRL2 A-A-G-G-A和TOMM40 T-A-T单倍型的人群能减少血脂异常的发病,而携带BCL3A-T-C-T、PVRL2 A-A-C-A-A、PVRL2 C-G-C-A-A、PVRL2 C-G-C-A-C、TOMM40 C-A-C和TOMM40 C-A-T单倍型则增加血脂异常的发病(P0.05-0.001)。进一步研究基因-基因间的交互作用后发现,最常见交互形式是A-C-A-T-A-A-G-G-A-T-A-T(15%的比例)。在两组人群中,A-CA-T-A-A-G-A-A-T-A-T、A-C-A-T-A-A-G-G-A-C-A-C、A-C-A-T-A-AG-G-A-C-A-T、A-C-A-T-A-A-G-G-A-T-A-T、A-T-C-A-A-A-G-G-A-TA-T、G-T-C-A-A-A-G-A-A-C-A-C、G-T-C-A-A-A-G-G-A-C-A-C和G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T基因间相互作用的单倍型比例存在差异。同时,携带A-C-A-T-A-A-G-A-A-T-A-T、A-T-C-A-A-A-G-G-A-TA-T和G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T的基因间相互作用单倍型具有保护作用,而A-C-A-T-A-A-G-G-A-C-A-C、A-C-A-T-A-A-GG-A-C-A-T、A-C-A-T-A-A-G-G-A-T-A-T、G-T-C-A-A-A-G-A-A-CA-C和G-T-C-A-A-A-G-G-A-C-A-C的交互效果则显示出增加发病率的功能(P0.01-0.001)。为评估基因-基因和基因-环境之间的交互作用对血脂异常的影响,使用GMDR模型进行分析,在调整协变量后(包括年龄、性别、BMI、血压、血糖、吸烟和饮酒)分析结果得知:rs296510、rs157580和rs439401 SNPs之间存在SNP-SNP的相互作用,同时rs2965101、rs8100239 SNPs和BMI24 kg/m2存在潜在的SNP-环境相互作用。进一步分析得知,单倍型-单倍型之间存在相互作用(PVRL2 AA-G-G-A,TOMM40 C-A-C和TOMM40 T-A-T)和单倍型-环境相互作用(TOMM40 C-A-C,TOMM40 T-A-T和BMI24 kg/m2,P0.001)。类似地,在两组人群中亦能发现基因-基因相互作用(A-C-A-T-A-A-G-G-A-C-AC、A-C-A-T-A-A-G-G-A-T-A-T和G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T)和基因-环境相互作用(G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T,年龄75且BMI24 kg/m2)。为了明确这些交互作用对血脂异常发病带来的影响,我们使用logistics回归分析了其相互作用。我们发现,与携带rs157580 CC和rs439401 TT基因型相比,携带rs157580 CT/TT和rs439401 CC/CT基因型的人群具有最低的血脂异常患病风险(校正OR=0.54,95%CI=0.32-0.93,P0.001)。当考虑SNP-环境相互作用时,我们发现携带rs2965101AC/CC基因型且BMI24 kg/m2的受试者增加血脂异常发病的风险(校正OR=1.08,95%CI=0.84-1.44,P=0.0015)。然而,当分析单倍型-单倍型和单倍型-环境相互作用时,我们可以发现PVRL2 A-A-C-A-A和TOMM40 C-A-C携带者(调整OR=5.47,95%CI=3.64-7.73,P0.001)和TOMM40 T-A-T携带者且BMI24kg/m2人群(校正OR=1.08,95%CI=0.75-1.54,P0.001)具有增加血脂异常的风险。当分析基因-基因和基因-环境相互作用时,我们发现A-C-AT-A-A-G-G-A-T-A-T和G-T-C-A-A-A-G-G-A-T-A-T携带者能够降低血脂异常风险(调整OR=0.88,95%CI=0.62-1.02,P0.001),而G-T-C-A-AA-G-G-A-T-A-T携带者且BMI24 kg/m2(校正OR=1.13,95%CI=0.85-1.49,P0.001)增加血脂异常发病的风险。结论:广西毛南族血脂异常组与正常组之间不同类别血脂水平存在差异,血脂水平与年龄、性别、腰围、血压、血糖、抽烟及饮酒等因素密切相关。毛南族BCL3-PVRL2-TOMM40基因簇SNPs不同基因型和等位基因携带频率与血脂异常水平存在关联,其单倍体携带情况在血脂异常和正常组中存在差异,且SNPs,单倍体与环境因素的相互作用也对患病风险产生重要影响。第二部分加权基因共表达网络构建分析与高脂血症相关的基因模块和核心基因背景及目的:目前心血管疾病是全世界范围内引起患者的死亡的主要原因之一。近年来,随着生活水平的提高,该病的发病率也逐年上升。高脂血症是影响其发生发展的关键因素之一,因此,预防高脂血症对心血管疾病的控制有着举足轻重的作用。根据现有的研究,高脂血症的发生发展受环境因素、遗传因素以及环境-遗传因素相互作用的影响。本研究通过数据挖掘,试图寻找高脂血症的潜在关键基因和发病途径,并研究与其相关的可能机制。方法:近来,随着基因芯片技术的不断开发,研究应用十分广泛,最主要的研究项目包括:基因表达谱测定、生物标记物检测、DNA序列测定、基因组文库作图及杂交测序、突变检测、疾病分类和多态性分析等。国际上常用基因芯片数据库主要有以下几种:由美国国家生物信息学中心(NCBI)成立的Gene Expression Omnibus(GEO)数据库、国家基因组中心的资源建立的基于Internet的基因表达数据库和英国的欧洲生物信息学中心建立的Arryexpress公共数据库等。这些数据库接收和保存全世界研究者提交的生物芯片数据,研究人员可以根据研究内容,选择性的下载别人芯片的原始数据作进一步的扩展性分析,成为大数据挖掘的信息来源途径之一。本研究在GEO数据库中,下载GSE3059的芯片数据,该数据包含13个已知的高脂血症样本。基因共表达网络是一种通过无尺度找寻具有协同表达效果的基因,并组件共表达网络调控模块的方法。该方法能将一组具有相似功能、相近功能或者同时出现在某个特定生物学通路中的基因聚集在一起,成分一个模块。研究人员则可根据某个未知功能的基因,出现所在的模块情况,推断该基因所具有的功能,同时也能进一步扩展推测其在模块中具有相同功能基因间的相互调控关系,从而将模块水平的探究和外在表型的关系联系起来。加权基因共表达网络构建(weighted gene co-expression networks analyzed,WGCNA)算法是目前被广泛应用于国际生物学领域的一种构建基因共表达网络的较为典型的生物学算法。进一步对这模块聚集到的基因进行分析,通过使用R语言中cluster Profiler和DOSE包完成基因功能注释(Gene Ontology annotation,GO)和京都基因和基因组途径富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analyses)。使用Cytoscape软件建立蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,并使用MCODE插件检测分析重要模块。最后通过RT-PCR来对核心基因进行功能验证。结果:本研究通过WGCNA分析了这13个样本基因-表型之间的关系,发现基因在salmon-中心粒细胞计数(R2=0.78,P0.01)和midnight blue-葡萄糖代谢(R2=0.67,P=0.01)两个模块具有最高的相关性。对这两个模块内的基因进行GO及KEGG分析发现:Salmon模块共有23个有意义的功能分析以及9条代谢相关通路;而Midnight blue模块具有11个有意义的功能分析以及3条代谢相关通路。通过PPI及MCODE分析后,综合判断得到五个基因(组蛋白去乙酰化酶4,HDAC4;F2R胰蛋白酶相似物受-1,F2RL1;含水解酶结构域-2,ABHD2;跨膜-4-六家族成-1,TM4SF1;以及家族序列相似性13-成员-A,FAM13A),这5个基因在高脂血症的发生发展过程具有重要意义。当用RT-q PCR验证时,HDAC4的相对表达较低,但F2RL1、ABHD2、TM4SF1和FAM13A在高脂血症中高于正常对照组(P0.05-0.01)。亚组分析显示,毛南族HDAC4的相对表达量较低,而F2RL1和ABHD2的表达高于汉族(P0.05)。结论:HDAC4具有使组蛋白去乙酰化的作用,结合生物信息学分析可知,除遗传因素和环境暴露外,表观遗传影响(组蛋白修饰)影响高脂血症发生和发展。毛南族人群高脂血症的发生可能与组蛋白修饰(表观遗传调控)有关,需要进一步证实及验证。第三部分血液中mi R-3659水平作为肥胖患者血脂异常的潜在诊断生物标志物的探讨背景及目的:肥胖在现代社会发展中是个不可回避的话题,随着对肥胖的研究深入,目前认为这是一种慢性的代谢紊乱性疾病,涉及基因、体内急速、环境影响等多种因素,其本质特点为脂肪囤积,是一种能量过量的表现。随着人们生活水平的不断提高,食物的种类及烹饪方式较过去有明显改善,近年来,人们花费在吃上的钱明显增多,但是愿意花费时间在运动上的人群却在减少,带来的后果则是超重和肥胖的人越来越多。同时,肥胖带来的不仅仅只是影响容颜,更重要的它还是心脑血管疾病的危险因素,能引起血脂异常、高血压、冠心病和糖尿病等多种代谢性疾病。有效的预防肥胖及其血脂异常的发生和发展能够减少心脑血管疾病的发病率及病死率。最新的研究表明,肥胖能被表观遗传的作用所调控,故本研究试图发现在肥胖人群中潜在引起血脂异常的关键基因,并通过生物信息学预测调控该基因的相关微小RNA(micro RNA),探讨其在肥胖人群中对于血脂异常的发生发展所提供的预测价值。方法:近来,大数据挖掘已逐渐成为疾病研究的热门技术。基因芯片技术能在疾病的基因谱上提供较多的信息,是疾病研究相关基因影响的一门重要技术。随着基因芯片技术的不断开发,它能提供的研究项目包括:基因表达谱测定、生物标记物检测、DNA序列测定、基因组文库作图及杂交测序、突变检测、疾病分类和多态性分析等。通常在完成芯片测序之后,会将相应的数据上传至指定数据库,供后人下载和做进一步研究分析,除了能够节省相关经费,也为课题的延续性做了良好的保证。目前能下载并使用的基因芯片数据库包括:由美国国家生物信息学中心(NCBI)成立的Gene Expression Omnibus(GEO)数据库、国家基因组中心的资源建立的基于Internet的基因表达数据库和英国的欧洲生物信息学中心建立的Arryexpress公共数据库等。这些数据库的建立大大的扩充了信息数据的来源,已逐渐成为大数据挖掘不可缺少的工具。对于挖掘到的芯片数据分析,也有很多方法,研究者可以根据自己的研究需要选择,而基因共表达网络是一种通过无尺度找寻具有协同表达效果的基因,并组件共表达网络调控模块的方法。该方法的核心思想为通过建立无尺度的相关性连接,将一组功能将近,或者集中在某个特定生物效应通路中发挥作用的一些基因聚集成一个模块,研究人员根据这些模块与相关表型的相应联系推测这些基因的功能,甚至能预测这些基因是否具有相应的调控关系的一种方法。加权基因共表达网络构建(weighted gene co-expression networks analyzed,WGCNA)算法是其中一种典型的生物信息学算法,它能构建无尺度下根据基因与表型功能的权重构建共表达网络,广泛应用于国际生物学领域中。本研究在GEO数据库中,下载GSE66676的芯片数据,该数据包含67个已知的肥胖个体,这些个体具有不同的血清血脂水平。通过分析,把这些在肥胖人群中引起血脂表型改变的基因聚集在某一模块内,进一步对模块内的基因进行分析,使用R语言中cluster Profiler和DOSE包完成基因功能注释(Gene Ontology annotation,GO)和京都基因和基因组途径富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analyses)。使用Cytoscape软件建立蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,并使用MCODE插件检测分析重要模块。挑选到关键基因后,通过生物信息学的方法预测与该基因具有调控作用的mi RNA,最后通过RT-PCR以及ROC曲线来对核心mi RNA进行功能验证以及推断其对血脂异常发病风险的预测价值。结果:本研究通过WGCNA分析了这67个样本基因-表型之间的关系,发现基因在grey60-甘油三酯水平(R2=0.98,P0.01)具有最高的相关性。对这个模块内的基因进行GO及KEGG分析发现该模块共有15个有意义的功能分析以及8条代谢相关通路。通过PPI及MCODE分析后,综合判断判定(胶原蛋白I型α1链,COL1A1)为核心基因。经过生物信息学预测后得知:共有4个mi RNA(hsa-mi R-3659、hsa-mi R-4658、hsa-mi R-151a-5p和hsa-mi R-151b)能特异性的结合在该基因的3’UTR上。当用RT-q PCR在血脂正常、异常组做验证时,只有hsa-mi R-3659和hsa-mi R-151-5p具有统计学意义。进一步通过ROC曲线进行分析,AUC hsa-mi R-3659=80.6%vs.AUC hsa-mi R-151-5p=76.9%(P0.05)。结论:COL1A1在肥胖人群中与血清甘油三酯水平呈正相关,结合生物信息学分析可知,表观遗传影响(非编码RNA)能特异性的结合该基因3’UTR上,影响血脂异常的发生,其中hsa-mi R-3659在肥胖人群中具有良好的血脂异常发病预测性,但具体的机制,需要进一步证实及验证。第四部分全基因组DNA甲基化和基因表达谱联合分析在冠心病发病机制中的作用背景及目的:目前冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病,CAD)仍是世界第一致死性疾病,其主要病变特点为动脉粥样硬化。引起CAD的原因很多,包括:年龄、性别、种族、高血压、高血糖、血脂异常、高同型半胱氨酸、肥胖、基因背景差异和不良生活方式等。根据世界卫生组织统计,预计世界各国因CAD而致死的人数将从1990年的4700万增加到2020年的8200万。2010年Framingham的研究表明,CAD的发病情况因年龄而异,其中18-44岁、45-65岁和65岁以上人群的发病率分别为1.2%、7.1%和19.8%。在性别上,绝经期前的女性发病率稍低,而绝经后的女性发病率明显升高。进一步的研究显示,在CAD人群中,其动脉粥样硬化斑块富含脂质泡沫细胞,为软斑块。此种软斑块进展迅速,易破裂,是冠状动脉血栓形成的主要原因。CAD患者多无先兆症状,急性起病,多表现为急性冠脉综合征,尤其是急性心肌梗死,病死率高。正常情况下,细胞是否能发挥某项特定的功能,是由细胞自身的基因表达谱所决定,经典遗传学认为遗传的分子基础是核酸,不同生命间的遗传信息均储存在核苷酸的碱基序列上。随着遗传学的不断进步和发展,DNA甲基化水平、组蛋白、染色质变异水平不同程度的修饰也会造成基因表达方式,表达数量的变化,并且这种改变是可以遗传的。因此,表观遗传学的可定义为,在不改变基因序列的情况下,调控基因表达,同时这种调控结果是可以通过细胞分裂的方式代代相传的。与核苷酸序列多态性相反,表观遗传变异是特异性的,动态的,甚至在整个生命过程中是可逆的,并且在机制上是多样的。DNA甲基化、组蛋白质修饰与非编码RNA(nc RNA)调控这3个层面均能影响并调控基因表达,是表观遗传学最重要的三个机制。因此,表观遗传学被认为是基因型和个体表型之间的桥梁。DNA甲基化,是指甲基基团在甲基化酶的作用下转移到DNA的碱基序列上,使之发生甲基化修饰。DNA甲基化最常见的区域为胞嘧啶磷酸盐-鸟嘌呤(Cp G)岛处,在人体细胞中,大约70%-80%DNA甲基化发生在整个基因组中的Cp G位点上,并受到DNA碱基序列和环境因素的共同作用发生变化。但随着研究的不断深入,许多非Cp G岛部位的胞嘧啶在特定情况下也能发生甲基化修饰。尤其是在基因启动子区,一旦胞嘧啶发生甲基化,基因特异性结构发生构象改变,能持续性的阻止转录因子的结合,或者通过重组染色质来阻碍基因的表达。通过全基因DNA甲基化及表达谱联合分析,不仅能发现致病基因内在的致病机理,更能为CAD的治疗提供足够的参考依据。方法:疾病的发生和发展是一个动态的变化过程,目前的芯片技术较以往逐渐成熟,但是单一芯片分析往往只能解释疾病发生发展过程中一个层面的内容,因此,多组学,多样本,多芯片的联合分析已经渐渐成为主流。本研究在GEO数据库中,下载GSE23561以及GSE107143的芯片数据。GSE23561为表达谱芯片,内含35人基因表达分析数据,其中包含CAD 6人,健康对照组9。GSE107143为全基因组DNA基因甲基化分析芯片,内含动脉硬化患者8人,健康对照8人。两块芯片样本来源均为外周血,且研究目的相近,样本数量及年龄匹配,符合联合分析条件。我们进行了:(1)全基因组DNA甲基化和m RNA表达谱分析,分别筛选两块芯片的差异基因后,进行比对,取交集后进入下一阶段;(2)使用R语言中cluster Profiler和DOSE包完成基因功能注释(Gene Ontology annotation,GO)和京都基因和基因组途径富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway enrichment analyses)。使用Cytoscape软件建立蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,并使用MCODE插件检测分析重要模块。挑选到关键基因;(3)通过焦磷酸测序及RT-PCR技术,在冠心病人群中对筛选到的11个不同甲基化位点及其相应基因表达的验证试验;(4)DNA甲基化与m RNA表达数据的相关性分析。结果:总共669个差异表达的m RNA与差异甲基化基因匹配。在疾病本体论,京都基因和基因组途径百科全书,基因本体论,蛋白质-蛋白质相互作用和网络构建和模块分析后,观察到11个对应于11个独特基因的差异甲基化位置(DMP),它们分别是:BDNF-cg26949694、BTRC-cg24381155、CDH5-cg02223351、CXCL12-cg11267527、EGFR-cg27637738、IL-6-cg13104385、ITGB1-cg20545410、PDGFRB-cg25613180、PIK3R1-cg00559992、PLCB1-cg27178677和PTPRC-cg09247619。在对11个可能相关的DMP和相应的基因表达进行验证测试后,我们发现冠心病组中CXCL12的低甲基化程度较低,冠心病患者中ITGB1、PDGFRB和PIK3R1的相对表达较低,但仅有CXCL12和ITGB1甲基化呈负相关。结论:通过研究,我们确定了全基因组DNA甲基化程度与基因表达之间的相关性,甲基化程度影响基因表达谱的改变,并证明了CXCL12甲基化在冠心病发病机制中的重要作用。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R541.4;R589.2
【部分图文】：

注：BMI=体重指数；TC=总胆固醇；TG=甘油三酯；HDL-C=高密度脂蛋白；LDL-C=低密度脂蛋白；ApoA1=载脂蛋白 A1；ApoB=载脂蛋白 B；ApoA1/ApoB=ApoA1 与 ApoB 的比值。3.2 PCR 产物电泳及限制性内切酶酶切产物电泳结果样本基因组DNA经过PCR扩增后2%琼脂糖凝胶电泳和紫外光成像。在限制性片段长度多态性（RFLP）反应之后，通过2%琼脂糖凝胶电泳成像，根据酶限制性位点的存在和不存在标记所鉴定的SNP的基因型，结果如图3-1所示：TG（mmol/L） 1.23（0.81） 3.46（1.91） 214.26 2.00E-013HDL-C（mmol/L） 1.69±0.48 1.50±0.40 14.162 1.73E-004LDL-C（mmol/L） 2.76±0.77 3.48±0.97 17.218 3.50E-005ApoA1（g/L） 1.37±0.29 1.38±0.26 0.814 0.367ApoB（g/L） 0.82±0.19 1.10±0.20 0.178 0.673ApoA1/ApoB 1.73±0.53 1.29±0.42 38.512 6.62E-010

基因  环境交互及表观遗传作用对血脂异常及冠心病影响的相关研究 博士学位论文（I） PVRL2 rs283810 A > C, AA （ 5 and 6）, AC （ 1 and 2）, CC （ 3 and 4）, （J） TOMM40rs157580 C > T, CC （ 5 and 6）, CT （ 1 and 2）, TT （ 3 and 4）, （K） TOMM40 rs2075650 A >G, AA （ 5 and 6）, AG （ 1 and 2）, GG （ 3 and 4）, （L） TOMM40 rs439401 C > T, CC （ 5and 6）, CT （ 1 and 2）, TT （ 3 and 4）。当DNA条带＜100bp时，在凝胶上无法显示。P1-P6: SNPs的PCR产物扩增结果，分别是 468-、 448-、541-、401-、390-、 430-、644-、 464-、382-、351-、493- and 222-bp。Figure 3-1 Single nucleotide polymorphism of BCL3-PVRL2-TOMM40 gene and restriction accountingendonuclease digestion product electrophoresis results.3.3 PCR 产物测序结果通过 PCR-RFLP 检测到的所有基因型，为保证分型结果的准确性，将酶切后产物经过测序证实。通过 Sanger 测序，证实了限制性内切酶基因分型的准确性。图 3-2 标注了 12 个 SNPs 在基因组上的相对位置，以及它们的测序结果。

图 3-4 反应了 BCL3-PVRL2-TOMM40 基因单核苷酸多态性基因型与血脂水平的存在关联，并且因个体携带基因型最小等位基因的情况不同，在血脂异常组和血脂正常组中发挥着不同的作用。我们发现在血脂异常组中；rs2965101、rs4803748、rs2965169、rs8100239、rs519113、rs6859, rs157580、rs2075650 and rs439401 最小等位基因携带者能引起 TC 改变；rs2965101、rs8100239、 rs10402271、 rs3810143、 rs6859、 rs283810 and rs157580 最小等位基因携带者能引起 TG 突变；而 rs2965101 位点的突变则导致 LDL-C 的异常。在血脂正常组中也能发现类似的趋势，rs2965169、rs519113 andrs157580 最小等位基因携带者引起 TC 改变，而 rs2965101、 rs8100239、rs6859 and rs157580 突变则改变血清 TG 的水平。（P < 0.05-0.001）。

本文编号：2824055