LS001通过LKB1-MARK2通路治疗再生障碍性贫血的研究

发布时间：2020-09-25 14:49

　　再生障碍性贫血(Aplastic anemia,AA),是由多种原因导致的造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)和/或造血微环境损伤,继而出现正常骨髓组织脂肪化、功能异常,血液中全血细胞减少的综合征,临床主要表现为贫血,感染和出血。再障是一个比较罕见的血液疾病,在中国发病率约为0.765/10万,在西方国家发病率低于亚洲地区,约为0.2/10万,患者以青少年居多。再障尤其是重型再障(severe aplastic anemia,SAA)是一种病死率极高的疾病,大多数病人因接触毒物或免疫异常有关,近年来呈明显增加趋势。再障临床及病理表现较为典型,在患者就诊时结合详细的实验室检查不难加以诊断。目前临床上采用的治疗方案包括骨髓干细胞移植,免疫抑制治疗以及支持治疗,随着近年来治疗手段的进步,再障患者的生存率得到了一定的提升,但仍然存在着巨大的挑战。这些挑战主要表现为:(1)由于再障是一种罕见病,临床上较难开展大样本的随机对照研究,一定程度上限制了治疗手段的进步。(2)有相当一部分病人由于HLA配型失败无法进行骨髓干细胞移植。(3)免疫抑制治疗药物属于大分子药物,只对约50%的病人显效,同时作用靶点广泛、不具有选择性,导致副作用较大,包括正常的免疫功能受到抑制,继发性肿瘤以及严重的肝肾毒性等。(4)干细胞移植、免疫抑制剂、输血等治疗手段费用昂贵,不适合我国国情。寻求经济安全的再障治疗药物已成为当务之急。近年来随着生物信息学和药物基因组学的迅猛发展,“大数据”分析成为医学科研和药物研发的有效手段,尤其对于研发罕见疾病的“孤儿药”具有非常实用和珍贵的价值。人类疾病的发生往往不是由于单个基因的改变,多是因基因组发生了异常变化的结果,而药物治疗疾病也是通过影响基因组进行,这是药物基因组学的核心理念。ConnectivityMap是由著名科研机构Broad Institute开发的药物基因组学工具,通过将药物相关的基因组和疾病特征性的转录组进行比对分析,筛选出可能治疗疾病的小分子化合物。我们利用互联网开放资源检索到再障发病相关的基因芯片数据,通过ConnectivityMap进行分析后发现小分子化合物LS001可能具有治疗再障的作用。LS001作为小分子化合物,临床上已经用来治疗其他疾病,具有成本低、副作用小的优点。目前尚未有关于LS001与再障相关的研究,但最新研究表明LiverKinase B1(LKB1)是造血干细胞(hemopoietic stem cell,HSC)维持造血的必要条件,而LS001与LKB1具有密切的关联。本课题试图在整体水平和细胞水平证实LS001对再障的保护作用;阐明药物保护作用的分子机制。提出假说:LS001通过LKB1-MARK2信号通路治疗再障。据此假设,我们进行了相关实验。结果如下:实验一:预测LS001对再障具有治疗作用在Gene Expression Omnibus数据库中检索到再障病人基因表达芯片数据GSE3807;通过GeneSpring GX软件对GSE3807进行差异表达基因分析,发现与健康志愿者比较,再障病人有515个基因发生了显著的差异表达,其中上调基因202个,下调基因313个;使用ConnectivityMap在线平台分析预测LS001可能具有治疗再障的作用。实验二:LS001在整体水平能够治疗再障~(60)Co-γ射线7.0Gy辐照ICR小鼠后给予300 mg/kg剂量的LS001能够显著延长小鼠生存时间(Log-rank P0.05)。相比生理盐水对照组小鼠,给药组小鼠血小板计数显著提升(1286±135×10~9/l vs 1055±143×10~9/l,P0.01),未成熟网织红细胞比例显著提高(10.31±9.83%vs 2.53±3.85%,P0.01),骨髓有核细胞数量显著升高(P0.01),骨髓造血面积显著恢复(P0.05)。实验三:LS001在细胞水平能够治疗再障~(60)Co-γ射线8.0Gy辐照原代骨髓细胞后给予1 mM剂量的LS001能够显著显著降低细胞凋亡比例,流式细胞术测得结果23.5±3.8%vs 39.3±5.6%(P0.01)。实验四:LS001对再障治疗依赖于LKB1~(60)Co-γ射线6.5 Gy辐照lkb1基因敲除小鼠后给予300 mg/kg剂量的LS001,野生型小鼠中给药能够显著延长小鼠生存时间(Log-rank P0.01);纯合子小鼠中给药不能延长小鼠生存时间(Log-rank P0.05)。~(60)Co-γ射线6.5 Gy辐照lkb1基因敲除小鼠后给予300 mg/kg剂量的LS001,血常规检测示LS001未能改善lkb1(-/-)小鼠PLT计数(986±216×10~9/l vs 965±205×10~9/l,P0.05);未能改善lkb1(-/-)小鼠RET比例(0.19±0.08%vs 0.20±0.05%,P0.05)。血常规检测示LS001能显著改善lkb1(+/+)小鼠血小板计数(PLT 1628±97×10~9/l vs1395±202×10~9/l,P0.05);能显著改善lkb1(+/+)小鼠RET比例(0.45±0.10%vs0.30±0.06%,P0.01)。正常ICR小鼠取骨髓进行原代骨髓细胞培养,培养24 h后在30 min,1 h,2 h,3 h,6 h,12 h及24 h不同时间点分别给药。WB检测LKB1及p-LKB1表达发现,与内参GAPDH表达相比,LKB1在各个时间点表达未发生显著变化,p-LKB1的表达在30 min即发生显著提高,在给药后约6 h达到表达高峰,随后表达逐渐降低。实验五:LKB1对再障的保护作用不依赖于AMPKMeg01细胞待生长至一定密度后给药组分别给予0.1 mM及1 mM的LS001,对照组给予等体积PBS,24 h后收集裂解细胞进行免疫共沉淀。结果显示:LS001随浓度增加使LKB1-AMPKα2结合显著增加,但不影响LKB1-AMPKα1的结合。在证实二者能够发生相互作用后,我们利用ampkα2基因敲除小鼠进行实验,验证AMPKα2是否参与对再障的保护作用。~(60)Co-γ射线6.5 Gy辐照ampkα2基因敲除小鼠后给予300 mg/kg剂量的LS001,血常规检测示LS001能够改善ampkα2(-/-)小鼠PLT计数(1243±106×10~9/l vs 936±99×10~9/l,P0.01);能改善ampkα2(-/-)小鼠RET比例(0.29±0.06%vs 0.21±0.05%,P0.01)。同时血常规检测示LS001能显著改善ampkα2(+/+)小鼠血小板计数(PLT 1533±85×10~9/l vs 1310±132×10~9/l,P0.01);能显著改善ampkα2(+/+)小鼠RET比例(0.51±0.10%vs 0.33±0.06%,P0.01)。实验六:LKB1对再障的保护作用依赖于MARK2,不依赖于MARK3Meg01细胞转染lv-GFP,lv-MARK2,lv-MARK3过表达慢病毒,~(60)Co-γ射线10.0Gy辐照后24 h后行Annexin-V/PI染色,1 h内行流式细胞术检测细胞凋亡,与lv-GFP对照组相比,过表达MARK2可显著降低Meg01细胞的凋亡比例(21.2±2.3%vs38.6±7.5%,P0.01);过表达MARK3不能降低Meg01细胞的凋亡比例(37.3±7.3%vs38.6±7.5%,P0.05)。Meg01细胞转染sh-Scramble,sh-MARK2,sh-MARK3干扰慢病毒,~(60)Co-γ射线10.0 Gy辐照后24 h后行Annexin-V/PI染色,1 h内行流式细胞术检测细胞凋亡,与PBS+sh-MARK2组相比,LS001+sh-MARK2不能显著降低Meg01细胞的凋亡比例(42.9±2.5%vs 40.1±3.4%,P0.05)。实验七:LKB1与MARK2的相互作用关系Meg01细胞待生长至一定密度后给药组分别给予0.1 mM及1 mM的LS001,对照组给予等体积PBS,24 h后收集裂解细胞进行免疫共沉淀。结果显示:LS001随浓度增加使LKB1-MARK2结合显著增加。Mark2基因敲除小鼠,野生型及纯合子分别取骨髓,行骨髓原代细胞培养,24 h后后分别用lv-GFP,lv-LKB1慢病毒进行转染,待病毒稳定转染后,10 Gy辐照造模。与野生型MARK2+lv-GFP组相比,野生型MARK2+lv-GFP组的细胞凋亡比例显著降低(流式:24.2±2.2%vs 30.1±1.9%,P0.01)。与纯合子MARK2+lv-GFP组相比,纯合子MARK2+lv-GFP组的细胞凋亡比例无显著变化(流式:43.5±5.7%vs 42.2±6.3%,P0.05)。实验八:LS001涉及到的细胞凋亡的初步机制研究。5只ICR小鼠,取骨髓细胞进行原代培养,待细胞长至合适密度后,分为两组,即对照组和辐照组。辐照剂量为7.0 Gy。24 h后提取细胞总蛋白,测定凋亡信号的表达情况。辐照造模后,线粒体通路的Bax,Bcl2以及死亡受体通路的Cle-caspase8的表达无明显变化;内质网通路的Cle-caspase12及凋亡终末信号Cle-caspase3的表达显著上升。MARK2基因敲除小鼠野生型和纯合子各4只,取骨髓细胞进行原代培养,待细胞长至合适密度后,分为两组,即对照组和辐照组,两组造模前再分别给予PBS和LS001。辐照剂量为6.5 Gy。24 h后提取细胞总蛋白,测定凋亡信号的表达情况。MARK2野生型小鼠给药后,骨髓细胞的Cle-caspase12和Cle-caspase3的表达均显著下降。而在MARK2纯合子小鼠给药后,Cle-caspase12和Cle-caspase3的表达无明显变化。LKB1基因敲除小鼠纯合子4只,取骨髓细胞进行原代培养,待细胞长至合适密度后,分为三组,即对照组,lv-GFP组和lv-MARK2组,待病毒稳转后造模。辐照剂量为6.5 Gy。辐照24 h后提取细胞总蛋白,测定凋亡信号的表达情况。LKB1基因敲除小鼠纯合子骨髓细胞转染过表达MARK2病毒,辐照造模后,骨髓细胞的Cle-caspase12和Cle-caspase3的表达均显著下降。MARK2基因敲除小鼠纯合子4只,取骨髓细胞进行原代培养,待细胞长至合适密度后,分为三组,即对照组,lv-GFP组和lv-LKB1组,待病毒稳转后造模。辐照剂量为6.5 Gy。辐照24 h后提取细胞总蛋白,测定凋亡信号的表达情况。MARK2基因敲除小鼠纯合子骨髓细胞转染过表达LKB1病毒,辐照造模后,骨髓细胞的Cle-caspase12和Cle-caspase3的表达无明显变化。结论:(一)LS001对再障具有确切保护作用。(二)LS001对再障的保护作用依赖于LKB1-MARK2通路。(三)LS001对再障的保护作用通过内质网通路的Cle-caspase12及凋亡终末信号Cle-caspase3。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R556.5
【部分图文】：

克隆载体,图谱

克隆载体pLenO-DCE图谱

实验流程,包装细胞,菌株,载体

目的基因慢病毒载体构建实验流程图

系统质,图谱,完全培养基,原件

图 3.慢病毒载体系统质粒图谱病毒包装流程病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别提，共转染 293T 细胞，转染后 8 h 更换为完全培养基，培养

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