中枢ADAM17介导膜上ACE2脱落在高血压心血管功能调控中的作用研究

发布时间：2020-10-08 17:45

　　【研究背景和目的】原发性高血压病是一种人类常见的慢性病,它是以血压升高为主要特征,并伴有血管、心脏等重要脏器并发症的一种严重威胁人类健康的疾病,发病率长期居高不下。有调查显示,我国有23.3%的成年人约2.45亿患有高血压病,而根据2017年美国心脏病协会/美国心脏协会新修订的高血压标准(收缩压≥130mmHg,舒张压≥80mmHg),我国高血压的患病率高达46.4%,而我国高血压的控制率为17%。因此,对高血压发病机理的研究和寻找更高效的的治疗策略,仍是当前生物医学界研究的热点。高血压病除外周心血管系统的一系列特征表现外,中枢神经系统交感输出亢进是高血压病发生和发展的重要机制之一。在中枢神经系统的众多核团中,头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是调控交感输出和基础血压的关键中枢,RVLM神经元功能异常与高血压和交感兴奋性增高密切相关。研究证实中枢肾素血管紧张系统(Renin-angiotensin system,RAS)过度激活是高血压病中枢交感输出的重要机制之一,增多的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)可以降低中枢压力敏感反射,增强中枢交感缩血管紧张性,导致血压的异常增高。血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2,ACE2)是肾素血管紧张系统家族中的新成员,ACE2将血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)和AngⅡ转化成血管紧张素-(1-7)[Angiotensin(1-7),Ang-(1-7)],并拮抗AngⅡ的升压效果而发挥作用,而RAS和ACE2相关轴之间的平衡对维持正常血压和自主神经功能的中枢调节非常重要。已有研究证实,原发性高血压状态下大鼠RVLM内ACE2的表达显著下降,而在该区域过表达ACE2可使血压和肾交感活性显著下降。因此,ACE2在中枢调控心血管功能中的作用十分显著,也是当前寻求新的高血压防治策略的研究靶点之一,但目前高血压中枢ACE2功能降低的机制尚不清楚。细胞中ACE2是I型跨膜蛋白,由细胞外的N端结构域、跨膜结构和一个短的胞内C末端组成,细胞外液中可溶性ACE2的形式为缺乏其胞内和跨膜结构域的胞外部分。ACE2的作用功能目前研究较为广泛,而上游对其调控的机理目前尚不清晰,研究较少。有研究显示镶嵌在细胞膜表面的解聚素和金属蛋白酶17(A Disintegrin and Metalloproteases 17,ADAM17)可以调节细胞ACE2活性,ADAM17可以剪切细胞表面的多种蛋白质,从而发挥其多样的生理功能。它在机体内很多个器官都有表达,参与了一些生理和病理进程。ADAM17在细胞膜表面可以通过蛋白水解作用,剪切细胞膜上的ACE2,使得ACE2胞外部分脱落,进入细胞外液,降低细胞膜上ACE2的活性功能,导致细胞外液的可溶性ACE2片段增多。在一型糖尿病秋田(Akita)小鼠肾小管中,ADAM17表达增加,它通过剪切细胞膜上ACE2使得尿液中的游离ACE2片段(70KDa)增加,给予胰岛素可逆转这一状况。有研究证实AngⅡ灌注下,心脏ADAM17活性增加,ACE2表达减少且活性下降,最终引起心脏肥大和纤维化。组织基质金属蛋白酶抑制剂3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP3)是ADAM17的内源性抑制剂,它可以抑制了ADAM17介导的底物胞外域脱落。有研究报道,AngⅡ诱导可以增加心肌TIMP3表达增加,而AngⅡ的灌流两周不能使TIMP3~(-/-)小鼠的心脏肥大,可见TIMP3参与AngⅡ诱导心肌肥大的病理过程。研究证实中枢脑组织中存在ADAM17的表达,其是否参与中枢特别是交感中枢RVLM内ACE2的调节,仍不清楚。有研究报道,白藜芦醇(resveratrol,RSV)在外周可以增加TIMP3表达,而果糖诱导的高血压大鼠口服RSV的1周后血压下降,那么RSV是否通过TIMP3/ADAM17作用,增加了中枢内ACE2的功能从而参与血压的调控呢,我们仍不清楚。RSV是一类多酚类化合物,具有多种的心血管调节保护功能。RSV在很多病理和生理条件下可以增加ACE2的表达和活性,改善疾病状态。如RSV通过上调腹主动脉和肾上主动脉的ACE2的表达和活性来抑制ApoE~(-/-)小鼠腹主动脉瘤的生长。此外,摄入RSV可以增加高脂饮食小鼠脂肪组织中ACE2的表达,而降低ACE的表达。此前,本课题组发现高血压大鼠中枢第四脑室灌流RSV产生抗高血压效应,且高血压大鼠RVLM内ACE2的变化直接影响血压和交感输出,而ACE2的活性受到ADAM17的调控,同时ACE2和ADAM17也受到AngⅡ的调节,那么RSV在中枢的抗高血压效应是否通过ADAM17蛋白介导调节RVLM内的ACE2活性来参与的呢?中枢RVLM内RAS系统异常是否通过ADAM17介导调节ACE2的活性并参与高血压的形成呢?因此,根据以上背景确立本课题的研究目标是(1)高血压大鼠中枢ACE2活性下降是否与TIMP3/ADAM17的异常相关,正常血压大鼠WKY中枢灌流AngⅡ能否在RVLM内通过TIMP3/ADAM17来降低ACE2活性;(2)RSV在交感中枢RVLM是能否来调节ACE2的表达和活性,能否对TIMP3/ADAM17通路产生调节作用;(3)在PC-12细胞中干扰TIMP3的表达,能否拮抗RSV对ADAM17和ACE2调节作用。【研究方法】实验动物为雄性正常血压Wistar Kyoto(WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR),动物体重在250-330g之间,细胞模型为PC-12细胞系。通过第四脑室灌流RSV对大鼠中枢施行持续定量给药,使用无创尾动脉法动态监测实验大鼠血压,使用脑定位微透析法对RVLM的细胞外液进行收集,采用WKY第四脑室灌流AngⅡ来确定其对RVLM内ADAM17和ACE2的影响,使用免疫荧光共聚焦法检测RVLM神经元ADAM17的表达,使用淬灭荧光底物检测脑组织及脑脊液中的ACE2活性。用AngⅡ诱导PC-12细胞下调ACE2的表达,使用TIMP-siRNA干扰来确定RSV是否通过ADAM17/TIMP3通路来调节ACE2,通过Western blot检测RVLM和细胞内ACE2等蛋白的表达变化,使用Elisa法检测RVLM组织内AngⅡ和Ang-(1-7)的含量【结果】一、高血压大鼠RVLM前交感神经元ADAM17表达增加免疫荧光检测显示大鼠RVLM前交感神经元存在ADAM17的表达;通过Western Blot检测大鼠ADAM17蛋白表达显示:SHR组的RVLM内ADAM17表达显著高于对照组WKY组(P0.05,n=5)。二、AngⅡ通过TIMP3/ADAM17途径下调RVLM内ACE2的功能(一)AngⅡ减弱RVLM细胞上ACE2功能而增强RVLM细胞外液ACE2活性。WKY第四脑室分别灌流人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,aCSF)和AngⅡ一周。相比灌流aCSF,灌流AngⅡ一周后平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR)显著增高[MAP:113±4 vs.151±4 mmHg;HR:360±5 vs.395±6beats/min(BPM),P0.05,n=5],使用试剂盒检测实验标本ACE2活性发现:灌流AngⅡ的WKY组(WKY+AngⅡ)RVLM组织内ACE2活性低于对照组(WKY+aCSF)的活性(454±44.7 vs.180±73.2 AFU/μg/min,P0.05,n=5),而RVLM的细胞外液(脑脊液)ACE2活性显著高于对照组(1370±470 vs.0 AFU/ml/min,P0.05,n=5)。Western Blot检测显示:灌流AngⅡ的WKY组RVLM组织内ACE2表达显著低于对照组(WKY+aCSF)。(二)AngⅡ减少RVLM组织内TIMP3表达并增加ADAM17表达。Western Blot检测显示:灌流AngⅡ的WKY-RVLM内ADAM17表达水平高于对照组(WKY+aCSF),而TIMP3的表达水平则低于对照组。三、中枢白藜芦醇(RSV)通过TIMP3/ADAM17通路上调高血压大鼠RVLM内ACE2功能第四脑室灌流实验分成四组WKY+aCSF、WKY+RSV、SHR+aCSF和SHR+RSV。(一)中枢RSV降低高血压大鼠的血压。SHR第四脑室灌流RSV(SHR+RSV)后,第5天血压开始下降,约在第7天下降至最低值后趋于平缓稳定,与对照组SHR+aCSF相比,SHR+RSV组血压显著下降(161±2 vs.143±2 mmHg,P0.05,n=5)。而WKY的血压与灌药前相比无明显变化(P0.05,n=5)。(二)RSV增加高血压大鼠RVLM组织ACE2活性,并减少RVLM细胞外液ACE2活性。使用试剂盒分别检测脑组织和透析液中的ACE2活性显示:SHR+aCSF组RVLM内细胞外液(脑脊液)的ACE2活性显著高于WKY+aCSF(1455±287 vs.0 AFU/ml/min,P0.05,n=8)而RVLM组织内的活性则显著低于WKY+aCSF组(291±13.2 vs.464.0±48.5 AFU/μg/min,P0.05,n=8);灌流RSV组的高血压大鼠(SHR+RSV)RVLM脑脊液中ACE2活性含量较对照组(SHR+aCSF)显著降低(607±48.3 vs.1455±287AFU/ml/min,P0.05,n=8),而RVLM组织内ACE2的活性则显著升高(399±12.8 vs.291±13.2 AFU/μg/min,P0.05,n=8)。(三)RSV增加高血压大鼠RVLM内Ang-(1-7)的含量并减少AngⅡ的含量。通过Elisa实验检测各组中Ang-(1-7)和AngⅡ的含量发现:SHR+aCSF组AngⅡ含量显著高于WKY+aCSF组(19.6±1.73 vs.9.26±0.72 pg/μg,P0.05,n=6);而Ang-(1-7)的含量则显著低于WKY+aCSF组(2.25±0.18 vs.4.48±0.44 pg/μg,P0.05,n=6);灌流RSV组的高血压大鼠(SHR+RSV)RVLM内AngⅡ含量较对照组(SHR+aCSF)显著降低(13.7±1.38 vs.19.6±1.73 pg/μg,P0.05,n=6),而Ang-(1-7)的含量则显著升高(3.95±0.172vs.2.25±0.18 pg/μg,P0.05,n=6)。SHR+aCSF组Ang-(1-7)/AngⅡ的比值显著低于WKY+aCSF(P0.05),灌流RSV的SHR+RSV组Ang-(1-7)/AngⅡ的比值显著高于SHR+aCSF(P0.05)。(四)中枢灌流RSV可以显著增加高血压大鼠RVLM内ACE2的表达。灌流一周后,SHR+aCSF组ACE2表达水平显著低于WKY+aCSF组,而灌流RSV组(SHR+RSV)的高血压大鼠ACE2表达水平较对照组(SHR+aCSF)明显升高。(五)RSV增加SHR-RVLM内TIMP3表达并减少ADAM17表达。Western Blot检测蛋白表达发现:SHR+aCSF组RVLM内ADAM17蛋白的表达水平显著高于WKY+aCSF组,而TIMP3蛋白的表达水平则显著低于WKY+aCSF组。高血压大鼠灌流RSV组(SHR+RSV)ADAM17表达水平较对照组(SHR+aCSF)显著降低,而TIMP3的表达水平则显著升高,而WKY两组之间的TIMP3和ADAM17蛋白表达则无显著变化。四、PC-12细胞中RSV通过TIMP3/ADAM17途径上调ACE2表达(一)AngⅡ增加PC-12细胞ADAM17表达水平并减少ACE2表达水平。使用AngⅡ100 nM和1000 nM两个浓度对分化后的PC-12细胞处理24小时,提取细胞蛋白,Western Blot检测发现:与对照组相比100 nM和1000 nM AngⅡ处理细胞可以显著下调ACE2表达并显著增加ADAM17表达,而100 nM与1000 nM两个浓度之间无显著差异。(二)RSV处理可以减弱AngⅡ对PC12细胞的调节作用,增加ACE2和TIMP3表达,减少ADAM17的表达。实验分为四组,Control+DMSO、Control+RSV、AngⅡ+DMSO和AngⅡ+RSV,提取细胞蛋白,Western Blot显示:AngⅡ+RSV组的ACE2和TIMP3的表达显著高于AngⅡ+DMSO组,而ADAM17表达则低于AngⅡ+DMSO组,但Control+RSV和Control+DMSO组的各蛋白表达则无明显差别。(三)PC-12细胞上干扰TIMP3表达,拮抗RSV对AngⅡ上调ACE2表达的作用。实验分成三组,PC-12细胞均在AngⅡ诱导的基础上进行处理,阴性对照组(Negative Control,NC),第二组为RSV处理的对照组(NC+RSV),第三组为TIMP-siRNA干扰的RSV处理组(siRNA+RSV),Western Blot检测发现:相对于NC组,NC+RSV组TIMP3和ACE2表达水平显著增高,ADAM17表达水平则显著降低;而相对于NC+RSV组,siRNA+RSV组ACE2和TIMP3的表达显著降低,ADAM17表达显著增加。【结论】高血压大鼠RVLM内ACE2表达与活性的下降与增多的中枢AngⅡ诱导的ADAM17功能增强相关,而中枢RSV通过TIMP3/ADAM17增加SHR-RVLM内ACE2的表达和活性,改善心血管功能,本研究揭示高血压中枢ACE2调节的新机理,为高血压的防治策略提供了新的思路。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R544.1
【部分图文】：

关键作用,血管,血压,脑卒中

前高血压导致的包括冠心病、心力衰竭、脑卒中、肾脏疾病在内的并发症致死和致残率很高[3]，给我国家庭和社会带来了沉重负担。目前有效降低血压仍是防治高血压病的首要策略[4]，有研究证实，降压治疗可分别降低心肌梗死风险 20%~25%、脑卒中风险35%~40%、心力衰竭风险 50%以上。因此，高效的预防和控制血压是减少我国心血管疾病乃至心脑血管事件发生率的有效办法。虽然目前针对高血压的药物已取得了重大进展[5]，而我国高血压的控制率为 17%[6]。因此，对高血压发病机理的研究和寻找更高效的治疗策略，仍是当前生物医学界研究的热点。原发性高血压病的发病原因很多[7]，而交感神经活动的异常增高的是其中一个重要的病因，也有研究表明，高血压的形成与发展与交感中枢功能异常密切相关[8]。脑干的头端延髓腹外侧区（rostral ventrolateral medulla, RVLM）是血压和交感调控的心血管调节中枢，它不仅承接着孤束核和室旁核等其它心血管调节中枢的神经冲动传入，同时其所含有的前交感神经元的纤维投射到脊髓中间外侧柱，与交感神经节前神经元发生单突触联系，调节外周血管、肾脏和心脏等心血管活动，从而调节控制血压。因此，RVLM 在血压和心血管功能的中枢调节中起到了关键作用，与原发性高血压病发生和发展关系密切[8]。

信号转导通路,中枢神经系统,中枢

中枢 ADAM17 介导膜上 ACE2 脱落在高血压心血管功能调控中的作用研外，也有研究表明活性氧参与 AngⅡ对 ADAM17 的调控，在 p47phox敲除的小鼠可少 AngⅡ引起的心肌 ADAM17 的磷酸化和激活，并保持其 ACE2 的水平，最终缓ngⅡ诱导的心脏功能紊乱和肥大[27]。组织基质金属蛋白酶抑制剂 3（tissue inhibitoretalloproteinases-3 ，TIMP3）是 ADAM17 的天然的内源性抑制剂，它可以抑制DAM17 介导的胞外域脱落。有研究报道，AngⅡ诱导可以减少心肌 TIMP3 表达增加 AngⅡ的灌流两周不能使 TIMP3-/-小鼠的心脏肥大[28]，可见 TIMP3 参与 AngⅡ诱肌肥大的过程。中枢脑组织中存在 ADAM17 的表达[29]，其是否参与中枢特别是交枢 RVLM 内 ACE2 的调节，是否受到中枢 AngⅡ的调控，从而参与原发性高血压的和发展，在其中发挥什么样的作用呢，目前尚不清楚。有研究报道，白藜芦醇（resveratSV）在人的血管平滑肌细胞中可以增加 TIMP3 表达而下调 ADAM17 的功能，而果导的高血压大鼠口服RSV的1周后血压下降[30]，那么RSV是否通过TIMP3/ADAM用，增加了 ACE2 的功能从而参与血压的调控呢，目前尚不清楚。

示意图,心肌,中枢,蛋白

海军军医大学博士学位论文而降低 ACE 的表达[34]。此前，本课题组发现中枢第四脑室灌流 RSV 可产生抗高血压效应，ACE2 在中枢 RVLM 的变化可直接影响血压和交感输出,那么 RSV 在中枢是否通过调节 ACE2 来调节心血管作用的呢？中枢 RVLM 内 RAS 系统异常是否通过 ADAM17介导调节 ACE2 的活性并参与高血压的形成？目前尚不清楚。

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